Name: optimization of a quantitative micro-neutralization assay
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

OBS! Biosäkerhetsnivån (BSL) för följande protokoll är BSL 2 för säsongsinfluensavirus och BSL 3+ för potentiella pandemiska influensavirus. Viral titrering krävs i förväg av en neutralisering experiment för att bestämma den virala koncentrationen av den virala kontrollen (VC). 1. virustitrering OBS! Beroende på antalet virus och antalet dubbletter, kan en brunnar inrättas med följande flexibilitet: (1) Den virala utspädning kan ordnas längs antingen rader eller kolumner (Figur 1). Varje virus bör ha en separat rad / kolumn. (2) Den virala utspädning ökning är flexibel, men det bör börja med den högsta viruskoncentrationen vid det övre vänstra hörnet. (3) Det finns ingen begränsning på antalet dubbletter. OBS: Madin Darby Canine Kidney (MDCK) och MDCK-SIAT1 (SIAT) celler tillhandahölls vänligen av Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germånga 10. SIAT celler är MDCK-celler stabilt transfekterade med den humana CMP-N-acetylneuraminat: p-galaktosid α-2,6-sialyltransferas-gen för ökad expression av sialinsyra (SA) α2-6Gal-terminerade oligosackarider. <ol><li> Alikvot tillräckliga MDCK-celler eller MDCK-SIAT celler 8 till 96-brunnsplattor (200 | il / brunn). Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 under 2 eller 3 dagar för att nå sammanflytning. Propagera cellerna i DMEM kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS) och antibiotika (100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin). Inkubera SIAT cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 och 1 mg / ml G418 sulfat. OBS: Utspädningsfaktorn är beroende av erfarenhet och cellinje som användes. Cellmonoskiktet måste sammanflytande (dvs ingen cellvägg eller synlig kontur för MDCK-celler och en tätt packad layout för MDCK-SIAT1 celler) vid tiden för virusinokulation. Exempel på spädningar baserat påsubkultur av konfluenta kolvar med MDCK eller MDCK-SIAT1 celler ges i tabell 1. </li><li> Tvätta cellerna 3 gånger med 200 | il av virustillväxtmedium (VGM) per brunn. Sterilisera flerskikts plattvättare med 70% EtOH under 30 min, och sedan skölja ur det i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller VGM före tvätten. </li><li> Aspirera VGM och omedelbart tillsätt 50 | il av VGM till varje brunn. </li><li> Lägg 900 pl VGM till var och en av 6 sterila rör (eller färre, beroende på antalet test virus och dubbletter). Pipettera 100 ul av virus i det första röret, blanda väl, och seriellt späda, ändra pipettspetsar mellan varje spädning. Upprepa för varje virus som skall titreras. OBS: Detta kommer att ge virusspädningar av 10 -1 till 10 -6. </li><li> Tillsätt 50 | il av varje virusspädning, med början vid den högsta utspädningen (1 x 10 -5 i figur 1), för att duplicerade brunnar (kolumnerna 9 och 10 i fig 1) av en 96-brunnar. </li><li> Placera plattan vid 37 ° C under 2-3 timmar för att göra det möjligt för viruset att infektera cellerna. OBSERVERA: En 2 till 3 timmars inkubering är nödvändigt för att säkerställa att de virus i inokulatet har tillräckligt med tid för att nå den monoskiktet. </li><li> Förbered overlay (10 ml / platta) OBS: överlagring består av 5 ml av 2x DMEM, Trypsin (2 | ig / ml slutlig koncentration), 20 ni av 1 mg / ml lager, och 5 ml av cellulosa bomullslinters (se Materials List). </li><li> Ta bort inokulat. </li><li> Lägg overlay (200 mikroliter till varje brunn). Inkubera över natten vid 37 ° C, ostört. OBS: Viruset knoppning sker efter ca 4 h, så det är viktigt att plattan inte störs efter denna tid. </li><li> Aspirera overlay från brunnarna. </li><li> Lägga iskall 4% paraformaldehyd i PBS A (200 | j, l / brunn). Placera dem vid 4 ° C under 30 min eller vid rumstemperatur under 20 min. OBS: PBS A är naturligt-pH fosfatbuffrad saltlösning med 10 gof NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na 2 HPO 4, 0,25 g KH 2 PO 4, och en L destillerat vatten (se Materials List). OBS: Paraformaldehyd är skadligt vid inandning och kan orsaka brännskador vid förtäring. Det finns också misstänks kunna ge cancer, och det kan ge allergi vid hudkontakt. </li><li> Aspirera paraformaldehyd och tvätta plattorna två gånger med PBS A (200 | j, l / brunn). </li><li> Förvara plattorna i PBS A vid 4 ° C för framtida användning, eller fortsätta med följande steg. </li><li> Lägg permeabilization buffert (100 | j, l / brunn). Lämna den i rumstemperatur i 30 minuter. </li><li> Tvätta plattan två gånger med PBS A (200 | j, l / brunn). </li><li> Tillsätt 50 pl av den första antikroppen, mus-MAb mot influensa typ A (1: 1000 i ELISA-buffert), per brunn. Inkubera det vid rumstemperatur under en timme (eller 4 ° C över natten), under skakning. </li><li> Tvätta det 3 gånger i 100 pl tvättbuffert (0,05% Tween 80 i PBS A, v / v) per väl. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter mellan tvättar. Alternativt, tvätta den 3 gånger utan inkubation med hjälp av 300 pl per brunn. </li><li> Tillsätt 50 pl av den andra antikroppen, get-anti-mus-IgG (H + L) HRP-konjugat (1: 1000 i ELISA-buffert), per brunn. Inkubera det vid rumstemperatur under 1 h, med skakning. </li><li> Tvätta den 3 gånger såsom beskrivits i steg 1,17. </li><li> Lägga substratet (50 | j, l / brunn). Inkubera det vid rumstemperatur under 30 min eller till dess att utvecklingen av en blå färg syns tydligt. </li><li> För att stoppa reaktionen, tvätta plattan två gånger med 200 | il destillerat vatten per brunn, inkubera vid rumstemperatur under 2 -3 min mellan tvättarna. </li><li> Lufttorka plattan och förvara den på en mörk plats (t.ex. slå in den i aluminiumfolie). </li></ol> 2. Titrering Kvantifiering <ol><li> Placera en brunnsplatta i skanningsområdet av en flatbäddsskanner, såsom visas i figur 2a. Använd L-form läge gränssäkerställa en optimal och repeterbar avbildning plats. OBS: Det är möjligt att avbilda två brunnsplattor i en skanning. </li><li> Skanna en bild. Anmärkning: Inställningarna visas i tabell 2. </li><li> Kör programmet &quot;Wellplate Reader&quot; för att beräkna den erforderliga viruskoncentration (Figur 3). <ol><li> Klicka på &quot;Load image&quot; för att ladda en bild. Skjut den röda stapeln i histogrammet för den &quot;globala Threshold&quot; fliken för att justera tröskelvärdet för provtagning. Klicka på &quot;Uppdatera&quot; för att undersöka effekten på bilden. </li><li> Markera &quot;Beräkna neutralisering / Titrering&quot; låda. Klicka på &quot;sampling&quot; för att kvantifiera ICP. Klicka på &quot;Spara&quot; för att spara provresultat när det efterfrågas. OBS: Efter samplingsprocessen, ett nytt fönster som heter &quot;neutralisering och titrering Beräkning&quot; visas automatiskt om &quot;Beräkna neutralisering / Titrering&quot; rutan är markerad. </li><li>Last eller mata in väl plattan definition karta. Indikerar tröskelvärdet (t.ex., 30%) i &quot;Titrering: Optimal Virus Population (%)&quot;. Välj &quot;titreringsprocessen&quot; -fliken för att beräkna titreringen resultat. Kontrollera titreringen resultat. Klicka på &quot;Spara och stäng&quot; för att spara titreringen resultat. OBS: Se kompletterande S1 för mer detaljerade instruktioner om programvaran. En kopia av den beställda programvaran finns tillgänglig på begäran. OBS: Vanligtvis den bästa virus utspädning för plackreduktionsanalys ger ca 50% (20-85%) ICP av totala celler i varje brunn 11. </li></ol></li></ol> 3. virusneutralisation OBS: Beräkna antalet plattor som krävs för neutralisationsanalysen. Varje platta kan rymma en virus och ett antal antisera. OBS! Beroende på antalet antisera och antalet duplikat, en brunnsplatta kan sättas upp med the efter flexibilitets: (1) Den serumutspädning kan arrangeras längs antingen rad eller en kolumn (Figur 4). Varje serum bör förfoga över ett separat rad eller kolumn. (2) ökning av serumutspädning är flexibel, men det bör börja med den högsta serumkoncentrationen vid det övre vänstra hörnet av en platta. (3) Antalet dubbletter balanserar antalet antisera. Fler dubbletter kan hjälpa till att jämna ut experimentella variationer. (4) Antalet VC och antalet cellkontroll (CC) dubbletter är flexibla, men de bör också vara i separata rader eller kolumner. Det förväntas att antalet VC dubbletter är betydligt större än den hos antisera. <ol><li> Förbereda cellmonoskiktet, såsom i stegen 1.1-1.3, 2 eller 3 dagar i förväg. </li><li> Tillsätt 50 pl av VGM till varje brunn i plattan. </li><li> Använd kolumner 11 och 12 för VC och CC respektive. Tillsätt 50 | il alikvoter av 1:20 receptorförstörande enzym (RDE) -behandlat serum till den första raden (A) i Columns 1-10. OBS: För varje virus och serum kombination, utförs analysen utfördes i duplikat, så en platta kan, till exempel, innehåller ett virus testades mot fem antisera. </li><li> Utför 2-faldiga seriespädningar genom att överföra 50 | il från rad A till rad H (Kolumnerna 1-10 i Figur 4) och kasta bort 50 ul från rad H. </li><li> Tillsätt 50 pl av spädningsmedel till varje brunn i CC-kolonn (Kolonn 12 i figur 4). </li><li> Tillsätt 50 | il av viruset till varje brunn i plattan, med undantag för den CC-kolonn (Columns 1-11, rader AH i figur 4). </li><li> Inkubera den vid 37 ° C under 2-3 h. Ta bort inokulat. Lägga överlägget (200 | il) till varje brunn. Inkubera över natten vid 37 ° C, ostört. Fix och färga plattorna som för virustitrering (steg från 1,11 till 1,22). </li></ol> 4. Neutralisering Kvantifiering <ol><li> Placera en brunnsplatta i skanningsområdet av en flatbäddsskanner, såsom visas i Figure 2a. Använd L-form läge gräns för att säkerställa en optimal och repeterbar avbildning plats. OBS: Det är möjligt att avbilda två brunnsplattor i en skanning. </li><li> Skanna plattan, som beskrivs i steg 2,2. </li><li> Kör programmet &quot;Wellplate Reader&quot; för att beräkna de nödvändiga virustitrar (Figur 3, steg 2,3). <ol><li> Klicka på &quot;Load image&quot; för att ladda en bild. Skjut den röda stapeln i &quot;Global gräns&quot; för att justera tröskelvärdet för provtagning. Klicka på &quot;Uppdatera&quot; för att undersöka effekten. </li><li> Markera &quot;Beräkna neutralisering / Titrering&quot; låda. Klicka på &quot;sampling&quot; för att kvantifiera ICP. Klicka på &quot;Spara&quot; för att spara provresultat när det efterfrågas. OBS: Efter samplingsprocessen, ett nytt fönster som heter &quot;neutralisering och titrering Beräkning&quot; visas automatiskt om &quot;Beräkna neutralisering / Titrering&quot; rutan är markerad. </li><li> Last eller mata in väl psen kartan. Indikerar tröskelvärdet (t.ex., 50%) i &quot;Neutralisering:. Infektion Avdrag (%)&quot; </li><li> Välj &quot;Neutralisation Process&quot; för att beräkna titrar. Kontrollera titer och klicka på &quot;Spara och stäng&quot; för att spara neutralisering resultat. OBS: Neutralisering rapporteras som det reciproka värdet av den högsta utspädningen av serumet med den fördefinierade ICP reduktion (såsom 50% eller 80%) mot VC (medelvärdet av Kolumn 11 i figur 4). En ICP minskning med 50% användes i Representativa resultat. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

I denna studie beskrev vi en avbildning baserad MN analys för att kvantifiera de verkliga antigen relationer mellan virus. Jämfört med andra plack-reduktionsanalyser, betonar metoden mätning av ICP av en hel brunn, vilket garanterar fullständig täckning av det infektiösa befolkningen. Dess oberoende plackbildning vidgar också tillämpningen av analysen för virus som kan bilda i huvudsak osynliga små plack eller som endast hanterar encelliga infektion. Därför är analysen kunna behandla fler virus och effekterna av ett bredare spektrum av antikroppar än HI, och det bidrar till mer omfattande återspegla de antigena likheter eller skillnader mellan virus 12. Till exempel när oseltamivirkarboxylat ingår, MN analysen påverkas mindre av NA-beroende bindning, vilket återspeglar de antigena skillnaderna mer exakt. Under utvecklingen av analysen gjordes stora ansträngningar gjorts för att förbättra experimentet konsistens, hastighet och detekteringkänslighet, bland annat genom att styra inmatnings virus genom kvantifieras titrering, avbildning i hög genomströmning med en flatbäddsskanner, och genomföra ett användarvänligt databehandling plattform. Resultaten har i allmänhet varit förenligt med och bekräftade de HI. Noterbart är resultaten visade också antigena skillnader mellan antigen drift varianter av senaste typ A och B vaccinvirus, liksom antigena förändringar som orsakas av kultur vald eller sporadiska förändringar, såsom G155E substitution i HA1 av vissa A (H1N1) pdm09 virus 12. Protokollet matchade virus typ eller subtyp med valet av cellinjer som gav den starkaste infektion, vilket kraftigt förbättrade avbildningssignalen. Experimentell variation var jämnas med utformningen av dubbletter som balanseras med antalet testade antisera. Osäkerhet kan också komma från bildkvalitet, som främst påverkas av avbildningsanordningen. Ett anständigt färg flatbäddsskanner kan signiligt förbättra bildens kontrast och minska bullret. Mängden tillfört virus i neutraliseringen skall bestämmas kvantitativt i förväg från motsvarande titrering medan virus ändå behålla en liknande status. Under neutralisation, är antiserumet svar på en infektion normaliserad mot skillnaden mellan referens virus (VC) och bakgrundsnivån (CC). Noggranna mätningar av VC och CC är avgörande för en neutralisering experiment. Fler dubbletter rekommenderas (åtta dubbletter användes i Representativa resultat). Slutligen, att förstå programvara är avgörande för framgången av ett experiment. Mjukvaran har testats för rutinviruskarakterisering i WHO influensa Centre, Storbritannien för mer än två år. Detaljerade instruktioner för att hantera olika situationer finns i den kompletterande S1. Denna MN analys är lämplig för applikationer där proverna täcker en extremely stort synfält men kräver endast måttlig avbildning upplösning. Den låga kostnaden och enkel installation gör systemet lätt tillgängliga för de flesta virologi laboratorier. Variationen i mätningar av samma prov var mindre än 3%, vilket ungefär definierar osäkerheten presenterad under avsökningen 11. Sådan reproducerbarhet är tillräcklig många virologiska studier och kan minskas ytterligare genom att ta medelvärdet bilder från flera skanningar. Sammanfattningsvis visar denna studie en robust MN analys som kan rutinmässigt används i antigen studie och stödja HI uppgifter i detaljerade analyser av närvarande cirkulerande influensavirus, särskilt för halvårs urval av virus för att ingå i humanvacciner mot influensa.

Mikro-neutralisation (MN) analyser används i virologi för kvantifiering av neutraliserande antikroppar och antivirala aktiviteter. Som ett alternativ av hemagglutination inhibition (HI) analyser, MN-analyser kan övervinna icke-antigena effekter påverkas av affinitetsförändringar av receptorbindande i influensavirus, som kan komplicera tolkningen av HI resultat 1,2,3. Fram till nyligen var de flesta MN-analyser baserade på cytopatiska effekter (CPE) eller enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN analyser baserade på minskning fokus och plack utvecklades 1990 6,7,8. Plackreduktionsanalyser är baserade på att räkna synliga plack att kvantifiera infektivitet. Men bara visuella räknar täcka stora plack som är upplösningen av mänskliga ögon, trots att majoriteten av plack är små och osynliga för många aktuella cirkulerande virus. Denna ofullständig täckning kan orsaka betydande variationer mellan examinatorer och mellan experiment, vilket leder till incomparable resultat. Det är också omöjligt att använda metoden när vissa virus visar misslyckade infektion av enskilda celler eller mycket små plack. Den dåliga räknings upplösning kan förbättras genom införande av en avbildande-baserat protokoll. Med framsteg inom teknik, optisk mikroskopi och hög genomströmning väl plattan läsare kan ge korrekta sätt att räkna de infekterade cellerna 9. Enligt en trans-belyst mikroskop, kan infekterade celler märkta med vissa markörer visualiseras genom deras absorption eller fluorescens kontrast i sub-cellulära upplösning. Ett prov kan sedan analyseras på en datorskärm. Tyvärr, på grund av begränsningar i synfältet, är mer än hundra kakel bilder krävs för att täcka en enda brunn. Analysera en platta med 96 brunnar skulle kräva avbildning och behandling av cirka tiotusen bilder. En sådan mödosam process är tidskrävande och dyrt, och upplösningen fick är i släktenl onödigt för rutinmässig karakterisering av virusinfektioner. Laboratorier med en begränsad budget kan det hända att den metod uppbyggd kring en flatbäddsskanner ger en kostnadseffektiv, hög genomströmning alternativ. I detta dokument beskriver vi en förbättrad plackreduktion MN analys som är lämplig för den antigena karakterisering av ett stort antal virus och för att kvantitativt mäta antivirala aktiviteter och neutralisering antikroppar. Analysen har flera fördelar: för det första är det ett avbildningsbaserad analys som kan mäta virusinfektioner på cellnivå, oberoende av plackstorlek. Räkna det totala infekterade cellpopulationen (ICP) inuti en brunn kraftigt ökar detektionskänsligheten, vilket gör det möjligt att karakterisera de virus med låg infektivitet. För det andra är en mer exakt kvantitativ titrering infördes före neutralisering för att bestämma mängden av tillfört virus. Den kvantitativa input-viruset minskar avsevärt variation mellan olika experiment och gör resultaten mer jämförbara mellan laboratorier. För det tredje, kan neutralisering titer bestämmas direkt genom att analysera bilder, vilket gör kvantifiering snabbt och användarvänligt. Slutligen tillhandahåller protokollet ett kostnadseffektivt och hög genomströmning alternativ med den erforderliga upplösningen och noggrannheten. Kvantifieringen är baserad på en flatbäddsskanner och fri mjukvara för databehandling. Hela installationen har ett litet fotavtryck och är sättas i de flesta laboratorier. Protokollet presenteras i detta dokument består av fyra viktiga steg, inklusive virus titrering, titrering kvantifiering, virusneutralisation, och neutralisering kvantifiering. Virustitrering är en beredning experiment som bestämmer mängden ingångs virus som skall användas i neutralisation. Under en titrering, är ett antal virala koncentrationer anbringas på cellmonoskikt i en 96-brunnars platta. De infekterade cellerna därefter kvantifieras i avsnitt 2. Den virala dilution som producerar 20% -85% ICP i sin tur används som ingångs virus till motsvarande neutralisering i avsnitt 3. halter av neutraliseringen protokollet kvantifieras med hjälp av avsnitt 4. Experiment som följde ovanstående protokoll presenteras i Representativa resultat. Analysen har testats grundligt under de senaste två åren med de flesta av de nuvarande cirkulerande influensavirus, såsom A (H1N1) pdm09, A (H3N2), och B-virus. Resultaten av influensavirus karakterisering ingick i rapporterna för WHO samrådsmötet som gav rekommendationer om influensavacciner för användning på södra halvklotet i 2016 och på norra halvklotet 2016-2017.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Efter ovanstående förfaranden, presenterar vi några resultat från de senaste antigena karakteriseringsexperiment. Titreringen installationen har utformats för att undersöka åtta ingångs virus, med dubbla kopior för varje utspädning. De virala utspädningar testades mellan 1,0 x 10 -1 och 1,0 x 1,0 -6 att täcka de variationer mellan de virus. Test virus var från H3N2-subtypen, inklusive A / Kamerun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015 A / Moskva / 103/2015 A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moskva / 101 / 2015, A / Moskva / 100/2015, A / Moskva / 133/2015, och A / Bratislava / 437/2015. Titreringen Resultaten illustreras i figur 5. Figur 5d visar minskningen av ICPn med ökningen av virusutspädning. Kurvorna normaliserades mot de ICPn av samma virus som gav infektioner hos alla celler inuti en brunn 12 (definierad som ICP mättnad). Om ICP inte mättas med highest viruskoncentration, var genomsnittet ICP från motsvarande dubbletter används istället (A / Moskva / 103/2015 figur 5d). Virus utspädningar som producerade 30% av ICP mättnad valdes som ingångsvirusspädning för neutralisering (tabell 3). Neutralisering syftar till att ha en ingång virus mot fem antisera, med dubbla kopior på varje platta. Referens virus visas är H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De fem antisera är A / HK 4801/14 Ägg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sydafrika R2665 / 15 Hjälpmedelsinstitutet F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, och A / holländsk 525/14 HI F23 / 15. Neutralisationen Resultaten illustreras i Figur 6. Figur 6d visar infektion framsteg med ökningen av serumutspädning. Den normaliserade positiva befolkningen på den vertikala axeln representerar förhållandet mellan ICP från motsvarande antisera svar mot den genomsnittliga ICPav referens virus 12. Bakgrunden ICP från oinfekterade cellkontroller subtraherades under normaliserings. Neutralisationen titrar bestämdes som de reciproka av de antiserumutspädningar motsvarar 50% ICP reduktion (Tabell 4). Linjär interpolering användes för att skatta titrar som faller mellan två närbelägna serumspädningar. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figur 1: Exempel på en väl platta setup i en virustitrering experiment. Test virus tilldelas separata rader (A till H). Kolumnerna är konstruerade för olika virusspäd (1 till 12). Två kolonner användes som dubbletter för varje virusspädning. Skalstreck = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 2: Schema av ett prov skanningssystem. (A) En 96-brunnsplatta på bildåtergivnings positionen av en flatbäddsskanner (publiceras från referens 11 med tillstånd från Elsevier), och (b) dimensionerna på L-formen ställning gräns som visas i (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figur 3: Stationär diagram av &quot;Wellplate Reader&quot; kvantifiering programvara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> </p&gt; <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figur 4: Exempel på en väl platta setup i en neutralisering experiment. Varje antiserum tilldelas två kolumner med dubbletter (1 till 10). Rader är konstruerade för olika serumspäd (A till H). Den viruskontroll tar kolumn 11, med åtta kopior (A11 till H11). Cell kontrollen är i kolumn 12, med åtta kopior (A12 till H12). Skalstreck = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figur 5: Resultat av en titrering experiment. (A) Den väl platta setup, (b) skannas väl platta bild, (c) illustrationav färgen-kodade, kvantifierades, virusinfekterad cellpopulation, och (d) normaliserade virusinfekterade cellpopulationer mot virusspädningar. 30% ICP användes som tröskeln. De felstaplar i (d) är standardavvikelser (SD) från provet dubbel (± 1 SD). Skalstrecken i (b) och (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figur 6: Resultat av en neutralisering experiment. (A) Den väl platta setup, (b) skannas väl platta bild, (c) illustration av kvantifieras, virusinfekterad cellpopulationen, och (d) normaliserad virusinfekterade cellpopulationen mot serumutspädning. Ingångs VIrus (VC) är A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP användes för att beräkna titer. De felstaplar i (d) är standardavvikelser (SD) från provet dubbel (± 1 SD). Skalstrecken i (b) och (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Kompletterande S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner filen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> typiska utspädnings </td></tr><tr><td></td><td> MDCK-celler </td><td> MDCK-SIAT1 celler </td></tr><tr><td> 2 dagar </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 dagar </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Typiska antalet celler per ml </td></tr><tr><td></td><td> MDCK-celler </td><td> MDCK-SIAT1 celler </td></tr><tr><td> 2 dagar </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 dagar </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Typiska späd på en subkultur av sammanflytande kolvar av MDCK eller MDCK-SIAT1 celler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Läge </td><td> Professional Mode </td></tr><tr><td> Dokumenttyp </td><td> Film (med film Area Guide) </td></tr><tr><td> Auto Exposure Type </td><td> Bild </td></tr><tr><td> Jag ärålder Type </td><td> 24-bitars färg </td></tr><tr><td> Upplösning </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Sparade bilden Format </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Typisk installation av en flatbäddsskanner. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Rad </td><td> Virus </td><td> Rekommenderad utspädning </td></tr><tr><td> en </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskva / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5,9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskva / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskva / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskva / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabell 3: Viral utspädningar beräknas från en population av 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kolumn </td><td> Antisera </td><td> Rekommenderad titer </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Sydafrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Schweiz / 9715293/2013 </td><td> 89,4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Nederländerna / 525/2014 </td><td> 78,6 </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Titrar på 50% ICP A / Stockholm / 63/2015 mot antisera.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Denna studie beskriver en imaging-baserade mikro neutraliseringstest för att analysera de antigena relationer mellan virus. Protokollet använder en flatbäddsskanner och har fyra steg, inklusive titrering, titrering kvantifiering, neutralisering, och neutralisering kvantifiering. Analysen fungerar bra med nuvarande cirkulerande influensa A (H1N1) pdm09, A (H3N2), och B-virus.

Optimering av en kvantitativ Micro-neutraliseringstest

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Mikroteststrips Dish biofilm bildning analys

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ utvärdering av cellmigration genom Phagokinetic Track Motility analys

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ bedömning av Human neutrofilmigrationen över en Odlade blåsans epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Upprättande och optimering av en hög genomströmning Setup för att studera<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Och<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som en modell för Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...