Name: study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells
Uploaded: 2016-12-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells at JoVE.com

Agradecemos a todas las personas en nuestro laboratorio que han contribuido a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por el INSERM y la Agencia Nacional de Investigación (ANR-09-jcjc-0116 Y ANR-11-BSV1-033-02). ET fue apoyado durante su doctorado por una beca de investigación del ministerio francés de educación superior y la investigación.

1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar 10% de formaldehído en PBS (baja en sal) diluyendo 5,5 ml de formaldehído al 37% en 14,5 ml de PBS. Preparar 1 M de glicina, pH 8,0, mediante la disolución de 3,8 g de glicina en 50 ml de PBS; diluir esta solución para obtener glicina 100 mM en 1 x PBS. </li><li> Preparar 0,1% de Triton-X100 en 1x PBS. Preparar 20x Saline citrato de sodio (SSC) utilizando cloruro de 3,0 M de sodio y citrato trisódico 0,30 M preparado en un tampón de agua desionizada con pH 7,0 a 25...

<ol>
	<li>Bravo-Sagua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+communication:+signaling+crossroads+between+homeostasis+and+disease.">Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 50, 55-59 (2014).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes:+composition,+molecular+mechanisms,+and+physiopathological+implications.">Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 22, 995-1019 (2015).</li><li>Phillips, M. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ER+membrane+contact+sites+with+other+organelles.">Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).</li><li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RTM+resistance+to+potyviruses+in+Arabidopsis+thaliana:+natural+variation+of+the+RTM+genes+and+evidence+for+the+implication+of+additional+genes.">The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes.</a> PLoS One. 7, 39169 (2012).</li><li>Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+mitochondrial+inner+membrane+cristae.">Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).</li><li>Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+tomography+of+rat-liver+mitochondria+and+their+interaction+with+the+endoplasmic+reticulum.">Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum.</a> Biofactors. 8, 225-228 (1998).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2++responses.">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280, 1763-1766 (1998).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Szabadkai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-mediated+coupling+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+Ca2++channels.">Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels.</a> J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).</li><li>Paillard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressing+Mitochondria-Reticulum+Interactions+Protects+Cardiomyocytes+From+Lethal+Hypoxia-Reoxygenation+Injury.">Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury.</a> Circulation. 128, 1555-1565 (2013).</li><li>Rieusset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+calcium+transfer+from+ER+to+mitochondria+links+alterations+of+mitochondria-associated+ER+membrane+integrity+to+hepatic+insulin+resistance.">Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance.</a> Diabetologia. 59, 614-623 (2016).</li><li>Allalou, A., Wahlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BlobFinder,+a+tool+for+fluorescence+microscopy+image+cytometry.">BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry.</a> Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).</li><li>Theurey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes+allow+adaptation+of+mitochondrial+metabolism+to+glucose+availability+in+the+liver.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver.</a> Journal of molecular cell biology. , (2016).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+anion-selective+channel+(VDAC)+in+the+plasma+membrane.">Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane.</a> FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).</li><li>Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortalin:+present+and+prospective.">Mortalin: present and prospective.</a> Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).</li></ol>

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

Las mitocondrias y del retículo endoplásmico (ER) no son orgánulos independientes en la célula, pero que interactúan estructural y funcionalmente en los sitios de contacto definidas como las membranas del retículo endoplásmico mitocondrias-asociado (MAM). De hecho, MAM corresponden a regiones en las que las membranas de la ER y mitocondrias están estrechamente yuxtapuestas, permitiendo interacciones entre las proteínas de ambos lados. No obstante, las membranas de estos orgánulos no se fusionan dentro de estas regiones, por lo que mantienen sus entidades separadas. Los MAM juegan un papel crucial en calcio (Ca2 +) y la transferencia de fosfolípidos de ER a las mitocondrias, lo que afecta el metabolismo energético y la supervivencia celular 1-3. La asociación entre el RE y las mitocondrias se visualizó por primera vez en la década de 1970 con el microscopio electrónico. Desde entonces, la microscopía electrónica de transmisión de 4,5, 6,7 o tomografía electrónica inmuno-localización de ER y mitocondrias específica fluoróforos / proteínas fluorescentes 8 fueron utilizados clásicamente para estudiar las interacciones ER-mitocondrias. Otra herramienta útil para el análisis de MAM se basa en el uso de fraccionamiento subcelular. Se permite el aislamiento de fracciones de MAM por ultracentrifugación diferencial acoplado a un gradiente de Percoll 9. Sin embargo, el producto final contiene fracciones enriquecidas MAM, en lugar de fracciones puras. En conjunto, estas estrategias no son particularmente sensibles y / o cuantitativa, y no son fácilmente susceptibles de gran proyección. Como alternativa, utilizando enfoques genéticos fluorescentes engarces entre orgánulos inducible con las drogas han surgido, pero no permitir que el análisis de las interacciones de los orgánulos en los niveles de expresión endógena de proteínas 10. Basado en el descubrimiento de Szabadkai del complejo IP3R / GRP75 / VDAC en el MAM 11, hemos desarrollado un método cuantitativo para analizar las interacciones ER-mitocondrias. Se utilizó la proximidad situ en ligatien ensayo para detectar y cuantificar las interacciones entre VDAC1 y IP3R1, dos proteínas orgánulo de superficie implicadas en la -channeling complejo Ca2 + en la interfaz de MAM en células fijadas 12. En pocas palabras, que probaron VDAC1 en la membrana externa mitocondrial (ratón anti-VDAC1 anticuerpo primario) y IP3R1 en la membrana ER (conejo anti-IP3R1 anticuerpo primario) (Figura 1, panel a). Entonces, de acuerdo con el ensayo, hemos añadido tanto anti-ratón y anti-IgG de conejo (sondas de ensayo de ratón y conejo proximidad ligadura), que se conjuga con extensiones de oligonucleótidos complementarios. Si las dos proteínas específicas, son a una distancia por debajo de 40 nm, los oligonucleótidos pueden hibridar con los oligos de conectores añadidos posteriormente para permitir la formación de una plantilla circular de ADN (Figura 1, panel B). Esta molécula de ADN circular se liga y se amplifica, la creación de un producto de ADN de cadena sencilla unido covalentemente a una de las sondas de proximidad (Figura 1, panel C) </strong&gt;. Dado que la distancia entre el ER y las mitocondrias en la interfaz de MAM se extiende de 10 nm a 25 nm 6, la ligadura de proximidad y la amplificación se pueden realizar, lo que lleva a la detección posterior debido a la hibridación de Tejas oligonucleótidos rojo marcado sondas (Figura 1, panel D ). Cada punto representa fluorescente interacciones entre VDAC1 / IP3R1, lo que permite la cuantificación de las interacciones in situ ER-mitocondrias en las células individuales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> Figura 1: ilustración esquemática de la detección de las interacciones retículo endoplásmico-mitocondrias por In Situ proximidad ligadura de ensayo. a) un anticuerpo primario de ratón dirigido contra VDAC1 y un anticuerpo primario de conejo dirigido contra IP3R1 puede unirse a sus epítopos en la proximidad a la interfaz de MAM, b) la adición de un par de sondas de ligación de proximidaddirigida contra ratón y IgG de conejo. Estas sondas se han unido las hebras de ADN que pueden formar plantillas para la ligación de oligonucleótidos de conector. c) La cadena de ADN circular formada después de la ligadura se puede amplificar y d) se visualizaron por microscopía fluorescente como un punto mediante el uso de oligonucleótidos de Texas rojo marcado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Similares en los experimentos de ensayo situ proximidad de ligación se puede realizar con el par GRP75 / IP3R1 de anticuerpos, así como la ciclofilina D (CypD) / anticuerpos IP3R1, teniendo en cuenta que CypD ha demostrado interactuar con el complejo de IP3R / GRP75 / VDAC en la interfaz MAM 12-14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">F-8775</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glycine</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">G-8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Triton</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">35mm Glass bottom culture dishes</td>
			<td style="width:169px;">MatTeK corporation</td>
			<td style="width:187px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92004 or DUO-92002</td>
			<td>provided in the Duolink PLA probes, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">VDAC1 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab14734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IP3R1-H80 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">sc28614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CypD antibody</td>
			<td style="width:169px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab110324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Grp75 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">sc13967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TBS 10X</td>
			<td style="width:169px;">euromedex</td>
			<td style="width:187px;">ET220</td>
			<td>Dilute to obtain 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tween 100X</td>
			<td style="width:169px;">euromedex</td>
			<td style="width:187px;">2001-B</td>
			<td>dilute in TBS to obtain 0,01%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PLA Probes Mouse MINUS</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92004</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PLA Probes Rabbit PLUS</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92002</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Duolink detection reagents red</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ligation solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ligase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Amplification solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Polymerase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Duolink Mounting Medium</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO80102</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Softwares:</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Blob-finder software</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis&#160;at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project&#160;ENLIGHT&#160;and&#160;&#160;Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Sobre la base de nuestra experiencia en el uso de este protocolo, con seguridad podemos recomendar este método para la visualización y cuantificación de las interacciones ER-mitocondrias en las células fijadas. Imágenes representativas de en las interacciones in situ de ligación proximidad de ensayo-visualizado ER-mitocondrias en la línea celular de hepatocarcinoma HuH7, utilizando varios pares de anticuerpos, se muestran. Como se muestra en la Figura 2</...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells at JoVE.com

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Investigación

Biología

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o<em&gt; En Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasa SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...