Name: rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays at JoVE.com

The authors thank Jessica Classen for performing the whole-cell patch-clamp experiments. The hiPSCs used in our experiments were kindly provided by Huiqing Zhou and Willem van den Akker from the Radboud University Nijmegen. The transfer vectors used in this protocol were kindly provided by Oliver Br&#252;stle, Philipp Koch and Julia Ladewig from the University of Bonn Medical Centre.

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The authors have nothing to disclose.

Ici , nous avons mis en place un protocole hiPSC-différenciation efficace publiée par Zhang et al. (2013) 12 pour mesurer l&#39;activité de réseau des réseaux neuronaux hiPSC dérivés sur les AME. Nous avons adapté le protocole original en créant une ligne de hiPSC -positifs rtTA / Ngn2 avant induction de la différenciation neuronale. Cette étape supplémentaire nous permet de contrôler la densité des cellules neuronales de la MEA. Le contrôle de la densité neuronale était une condition préalable importante pour adapter le protocole aux AME et d&#39;assurer la cohérence. Pour mesurer l&#39;activité des réseaux de neurones en utilisant les AME, les neurones ont besoin pour former des réseaux denses directement au - dessus des électrodes de MEA 17,18. Cela exige nécessairement un contrôle serré sur la densité de placage des neurones. La ligne de hiPSC -positifs rtTA / Ngn2 permet un contrôle de la densité des neurones , car cette tactique ne repose pas sur transductions lentiviraux aiguës de hiPSCs avant la différenciation;par conséquent , la ligne de hiPSC -positif rtTA / Ngn2 élimine pratiquement toute variation du rendement final en raison, par exemple, la toxicité et l&#39; efficacité lentiviral d&#39;infection variable. Une autre étape critique du procédé expérimental est le nombre d&#39;astrocytes de rat qui sont co-cultivées avec les hiPSCs différenciant. Les astrocytes contribuent activement à l&#39;affinement de développer des circuits neuronaux en contrôlant la formation des synapses, la maintenance et l&#39;élimination, qui sont tous des processus importants pour le fonctionnement neuronal. Le protocole présenté dans ce document est très astrocyte dépendante: à pleine maturité et forment des synapses fonctionnelles, les neurones ont besoin de soutien des astrocytes. Nous avons connu que le nombre d&#39;astrocytes devrait être à peu près égal au nombre de neurones hiPSC dérivés pour soutenir la maturation des neurones et la formation de réseaux de neurones présentant une activité spontanée. Depuis nos astrocytes protocole rendements cul de cellules primairestures ayant une durée de vie limitée, l&#39;isolement des astrocytes de rat doit être effectué régulièrement. Notre adaptation du protocole publié par Zhang et al. (2013) 12 pour une utilisation avec la technologie MEA sera probablement améliorer considérablement notre capacité à étudier l&#39;activité de réseau de réseaux hiPSC dérivés. Auparavant, les protocoles utilisés pour l&#39; étude des réseaux neuronaux hiPSC dérivés des AME comptaient sur les procédures de différenciation chronophages 13-16. Le protocole de Zhang et al. (2013) fournit une alternative rapide et notre modification supprime une source de variabilité, ce qui rend maintenant plus possible d&#39;utiliser des neurones hiPSC dérivés en combinaison avec la technologie de la MEA, en particulier dans un haut débit ou d&#39;études pharmacologiques. En outre, parce que la méthode publiée par Zhang et al. (2013) 12 cède une population homogène de la couche supérieure des neurones corticaux, notre protocole adapté rend possible des études ciblées dans le réseau unctivité de ce sous-ensemble neuronal particulier. Néanmoins, cette approche présente plusieurs limites. Tout d&#39; abord, l&#39;homogénéité des cultures peut également être considéré comme un inconvénient, parce que les cultures sont moins susceptibles de ressembler à des réseaux in vivo, où les différentes classes de neurones (c. -à- neurones excitateurs et inhibiteurs) constituent un réseau hétérogène. Pour améliorer encore l&#39;utilisation des neurones hiPSC dérivés avec la technologie MEA, il sera important d&#39;élaborer des protocoles de différenciation rapide (basée transgène) pour d&#39;autres populations de cellules neuronales. Si les protocoles deviennent disponibles, les réseaux in vitro pourraient imiter plus étroitement les réseaux in vivo. En second lieu , à l&#39; heure actuelle des astrocytes de rat doit être ajouté aux neurones hiPSC dérivés d&#39;aide à la croissance, et par conséquent le réseau neuronal résultant est pas un réseau de neurones stricto sensu humaine. protocoles fiables pour différencier en astrocytes hiPSCs peut dans le sol avenirve ce problème 26. Troisièmement, les réseaux de neurones bidimensionnels, tels que décrits ici, sont un modèle d&#39;étude limitée des réseaux complexes tridimensionnelles in vivo des neurones. Heureusement, des protocoles décrivant des cultures tridimensionnelles de neurones primaires de rat en combinaison avec la technologie de la MEA sont déjà disponibles 27,28. Prospectivement, la combinaison de protocoles de différenciation rapides pour obtenir des neurones et des astrocytes hiPSC dérivés avec des techniques de culture en trois dimensions et de la technologie de MEA devrait fournir un nouvel aperçu des mécanismes biologiques sous-jacents des troubles neurologiques.

Le développement de l&#39; origine humaine cellules souches pluripotentes (hiPSCs) protocoles de différenciation pour générer des neurones humains in vitro a fourni un nouvel outil puissant pour l&#39; étude des troubles neurologiques. Jusqu&#39;à récemment, l&#39;étude de ces troubles a été sévèrement entravée par l&#39;absence de systèmes modèles utilisant les neurones humains. Bien que les rongeurs peuvent être utilisés pour étudier les troubles neurologiques, les résultats de ces études ne peuvent pas être convertis facilement à l&#39; homme 1. Compte tenu de ces limitations, les neurones hiPSC dérivés sont un modèle alternative prometteuse qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires sous - jacents et les troubles neurologiques in vitro pour le dépistage de la drogue. Dans la dernière décennie, plusieurs protocoles pour convertir hiPSCs dans les neurones ont été développés 2-8. Cependant, ces protocoles sont encore limités à bien des égards. Tout d&#39; abord, les protocoles sont souvent beaucoup de temps: les neurones électrogènes à maturation adéquate (c. -à- synapformation se) et l&#39; activité fonctionnelle nécessite des mois de procédures de culture, ce qui rend difficiles études 9 à grande échelle. En outre, l&#39;efficacité de conversion-hiPSC à neurone est faible. Les protocoles donnent souvent une population hétérogène de neurones, et donc ne permettent pas des études sur des sous-ensembles spécifiques de cellules neuronales. En outre, les protocoles ne sont pas reproductibles, ce qui donne des résultats différents pour les différentes lignes iPSC 10,11. Enfin, le stade de maturation et les propriétés fonctionnelles des neurones résultant 10 sont également variables. Pour résoudre ces problèmes, Zhang et al. (2013) 12 ont développé un protocole qui génère rapidement et de manière reproductible à partir de neurones humains hiPSCs en surexprimant le facteur de transcription neurogénine-2. Tel que rapporté par les auteurs, la différenciation se produit relativement rapidement (seulement 2 - 3 semaines après l&#39;induction de l&#39;expression de neurogénine-2), le protocole est reproductible (propriétés neuronales sont indépendantes des sepuis ligne hiPSC), et la conversion-hiPSC à neurone est très efficace (près de 100%). La population de neurones générés avec leur protocole est homogène (ressemblant à la couche supérieure des neurones corticaux), permettant l&#39;examen des contributions spécifiques du type cellulaire à des troubles neuronaux. En outre, leurs neurones hiPSC dérivés présentaient des propriétés matures (par exemple, la capacité de former des synapses et de l&#39; activité fonctionnelle robuste) après seulement 20 d. Caractériser les propriétés électrophysiologiques des neurones hiPSC dérivés au niveau du réseau est une condition préalable importante avant que la technologie hiPSC peut être exploitée pour l&#39;étude des maladies humaines. Pour cette raison, de nombreux groupes de recherche ont récemment commencé à enquêter sur les neurones de cellules souches dérivées au niveau du réseau à l&#39; aide de réseau de micro-électrode (MEA) périphériques (systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne) 13-16. Les électrodes d&#39;un MEA sont noyées dans un substrat sur lequel les cellules neuronales peuvent être cultivées.AME peuvent être utilisés pour explorer les propriétés électrophysiologiques des réseaux neuronaux et le développement in vitro de leur activité. À l&#39;heure actuelle, les AME sont utilisés uniquement en combinaison avec des protocoles de différenciation qui prennent plusieurs mois pour obtenir des réseaux matures. Par conséquent, la combinaison AME avec un protocole de différenciation rapide devrait faciliter l&#39;utilisation de cette technologie dans des études à grande échelle des troubles neurologiques. Ici, nous présentons une modification de la Zhang et al. (2013) 12 protocole et l&#39; adapter pour une utilisation sur les AME. En particulier, plutôt que de compter sur une lentiviral transduction aiguë, nous avons créé à la place des lignes hiPSC exprimant de manière stable rtTA / Ngn2 avant induction de la différenciation. Nous l&#39; avons fait surtout d&#39;avoir un contrôle reproductible sur la densité des cellules neuronales, puisque la densité des cellules neuronales est critique pour la formation de réseau neuronal, et un bon contact entre les neurones et les électrodes de la MEA 17,18. although Zhang et al. protocole est très efficace en ce qui concerne la conversion des hiPSCs transduites, il est intrinsèquement variable par rapport au rendement final des neurones à partir du nombre de hiPSCs plaqué initialement (voir la figure 2E dans Zhang et al.) 12. Avec une ligne stable, nous éliminons de nombreux problèmes qui causent la variabilité, comme la toxicité lentiviral et l&#39;efficacité de l&#39;infection. Nous avons ensuite optimisé les paramètres qui produisent de manière fiable des réseaux neuronaux hiPSC dérivés sur les AME, l&#39; obtention de la maturation du réseau (par exemple, les événements synchrones impliquant une majorité des canaux) de la troisième semaine. Ce protocole rapide et fiable devrait permettre des comparaisons directes entre les neurones dérivés de différentes (c. -à- spécifique au patient) lignes de hiPSC ainsi que de fournir une cohérence solide pour les études pharmacologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="805">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lebovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11415-064</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">0080085SA</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P6407</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ca2+/Mg2+-free HBSS&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14175-095</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">0.05 % Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">2.5 % Trypsin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">15090-046</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">High-glucose DMEM</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">FBS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">F2442-500ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P4333</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:99px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:180px;">352350</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DPBS</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14190-094</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">psPAX2 lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12260</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">pMD2.G lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12259</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1413201</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11320-074</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">A6964</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">E8 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1517001</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A2644501&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Polybrene</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">H9268-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">G418</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">G8168-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Puromycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P9620-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Vitronectin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A14700</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">6-well MEAs</td>
			<td style="width:99px;">Multi Channel Systems</td>
			<td style="width:180px;">60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">631-0899</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P3655-10MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Laminin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">L2020-1MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Doxycyclin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D9891-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">17502-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">M7145</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">NT-3, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66425</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">BDNF, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66212</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">35050-038</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">21103-049</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">C1768-100MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Straight fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">11251</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fine-tipped spring scissors&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">91500-09</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays

Neurones dérivés des humains induite par cellules souches pluripotentes (hiPSCs) fournissent un nouvel outil prometteur pour l&#39;étude des troubles neurologiques. Dans la dernière décennie, de nombreux protocoles de différenciation hiPSCs dans les neurones ont été développés. Cependant, ces protocoles sont souvent lents avec une forte variabilité, une faible reproductibilité, et une faible efficacité. En outre, les neurones obtenus avec ces protocoles sont souvent immatures et dépourvus d&#39;activité fonctionnelle adéquate tant au niveau unicellulaires et réseau à moins que les neurones sont cultivés pendant plusieurs mois. En partie à cause de ces limitations, les propriétés fonctionnelles des réseaux neuronaux hiPSC dérivés ne sont pas encore bien caractérisés. Ici, on adapte un protocole publié récemment qui décrit la production de neurones humains provenant hiPSCs par l&#39; expression forcée du facteur de transcription neurogénine 2-12. Ce protocole est rapide (produisant les neurones matures dans les 3 semaines) et efficace, avec près de 100% l&#39;efficacité de conversion TRANSDUCcellules ed (&gt; 95% des cellules DAPI-positives sont MAP2 positive). En outre, le protocole donne une population homogène de neurones excitateurs qui permettraient à l&#39;enquête sur les contributions spécifiques de type cellulaire à des troubles neurologiques. Nous avons modifié le protocole original en générant des cellules hiPSC transduites de manière stable, nous donnant un contrôle explicite sur le nombre total de neurones. Ces cellules sont ensuite utilisées pour produire des réseaux de neurones hiPSC dérivées sur des réseaux de micro-électrodes. De cette manière, l&#39;activité électrophysiologique spontanée des réseaux de neurones hiPSC dérivés peut être mesuré et caractérisé, tout en conservant la cohérence interexperimental en fonction de la densité cellulaire. Le protocole présenté est largement applicable, en particulier pour des études mécanistiques et pharmacologiques sur les réseaux neuronaux humains.

Ici , nous avons réussi à modifier un protocole dans lequel hiPSCs sont différenciés directement dans les neurones corticaux par surexpression du facteur de transcription neurogénine-2 12 et nous l&#39; avons adapté pour l&#39;utilisation des AME. Cette approche est rapide et efficace qui nous permet d&#39;obtenir des neurones fonctionnels et l&#39;activité du réseau déjà au cours de la troisième semaine après l&#39;induction de la différenciation. Au cours du protocole de différenciation, les cellules ont commencé à ressembler morphologiquement neurones: les petits procédés ont été formés et les neurones ont commencé à relier les uns aux autres (figure 1A). Nous avons établi un profil neurophysiologique des neurones dérivés d&#39;une lignée de hiPSC saine contrôle, en mesurant leur morphologie neuronale et les propriétés synaptiques au cours du développement. neurones hiPSC dérivés ont été colorées pour MAP2 et synapsine-1/2 à différents jours après le débutde différenciation (figure 2A). Les neurones dérivés montrent la morphologie des neurones matures déjà 3 semaines après l&#39;induction de la différenciation. Le nombre de synapsine-1/2 lacrymaux (une mesure du nombre de synapses) a été quantifiée sur la base / 2 colorations immunocytochimie 1 synapsine. Le nombre de synapsine-1/2 lacrymaux a augmenté au fil du temps, ce qui suggère que le niveau de connectivité neuronale augmente également (figure 2B). Le nombre de synapsine-1/2 lacrymaux 23 jours après l&#39;induction de la différenciation était similaire dans les deux lignées indépendantes IPS (figure 2C). A 23 DIV plus synapsin1 / 2 puncta ont été juxtaposée à PSD-95 lacrymaux, qui est indicatif de synapses fonctionnelles (Figure 2D). En accord avec les résultats décrits par Zhang et al., Nous avons généré une population de neurones corticaux couche supérieure excitateurs, confirmée par m corticales spécifiques de sous - type pan-neuronale et<html> arkers tels que BRN2 et SATB2 (couche II / III). Nous n&#39;avons pas observé les neurones positifs pour les neurones de la couche profonde CTIP2 (couche V) ou FOXP2 (couche VI) (Figure 2E et F) Pour caractériser l&#39;activité électrophysiologique des neurones hiPSC dérivés, nous avons utilisé en cours de cellules entières et des enregistrements de serrage de tension, à savoir les propriétés intrinsèques et entrée excitatrice sur ces neurones ont été mesurés au cours du développement. Les neurones ont été capables de générer des potentiels d&#39;action déjà une semaine après la différenciation et le pourcentage d&#39;ensemencement des cellules a été augmenté au cours du temps (figure 2G et H). En outre, les neurones ont reçu entrée synaptique excitatrice déjà une semaine après l&#39;induction de la différenciation: à la fois la fréquence et l&#39; amplitude de l&#39;entrée synaptique excitatrice a augmenté au cours du développement (figure 2I - K). nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Pour mieux comprendre comment l&#39; activité cellule unique combine pour former des fonctions au niveau du réseau, il est essentiel d&#39;étudier comment les neurones travaillent de concert in vitro réseaux neuronaux cultivés sur les AME. constituent un modèle expérimental précieux pour l&#39; étude de la dynamique neuronales. Nous avons enregistré 20 min de l&#39; activité réseau électrophysiologique des neurones dérivés d&#39;une lignée de hiPSC saine maîtrise en culture sur 6 puits AME (Figure 2M). Quelques semaines après l&#39;induction de la différenciation, les neurones dérivé de hiPSCs sain de contrôle formé des réseaux neuronaux fonctionnellement actifs, montrant des événements spontanés (0,62 ± 0,05 pic / s; Figure 2N). A ce stade de développement (soit 16 jours après le début de la différenciation) pas d&#39; événements synchrones impliquant tous les canaux . des AME sont détectés (Figure 2O) le niveau d&#39;activité du réseau a augmenté au cours du développement: au cours de la quatrième semaine après t<html> il induction de la différenciation, les réseaux de neurones a montré un niveau élevé de l&#39; activité spontanée (2,5 ± 0,1 pic / s; Figure 2N) dans tous les puits du dispositif. Les réseaux également exposés rafales synchrones de réseau (4,1 ± 0,1 rafale / min, Figure 2O) avec longue durée (2.100 ± 500 ms). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" /> Figure 1: hiPSC Différenciation dans Neurones. R. Trois points de temps de différenciation en neurones hiPSCs sur les lamelles couvre -objet . B. Placage des hiPSCs sur les AME. C. astrocytes à 100% de confluence dans T75 flacon ( à noter que les cellules forment une monocouche tessellated). Barres d&#39;échelle: 150 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" /> Figure 2. hiPSC dérivées Neurones Caractérisation. Neurones A. hiPSC dérivés ont été colorées pour MAP2 (vert) et synapsine-1/2 (rouge) à différents jours après le début de la différenciation. Barre d&#39;échelle: 10 um. B. Quantification de la synapsine lacrymaux dans deux expériences indépendantes. Dans chacune des expériences d&#39;au moins 10 cellules ont été analysées. C. Quantification de puncta synapsine à DIV23 dans les neurones dérivés de deux lignes IPS indépendants. Neurones D. hiPSC dérivées ont été colorées pour PSD-95 (vert) et Synapsin-1/2 (rouge) 23 jours après le début de la différenciation. puncta Synapsin sont juxtaposées à PSD-95 lacrymaux. Neurones E. hiPSC dérivés ont été colorées pour MAP2 (vert) et BRN2 (rouge) ou SATB2 (rouge) 23 jours après le début de la différenciation. F. Pourcentage de cellules positives que MAP2étaient positifs pour les marqueurs indiqués. G. représentatifs des enregistrements de serrage actuelle montrant que les potentiels d&#39;action peuvent être générés dès 7 jours après le début de la différenciation. H. Pourcentage de cellules à différents jours après l&#39;induction de la différenciation qui montrent un ou plusieurs potentiels d&#39;action. I. traces représentatifs de courants postsynaptiques excitateurs (de EPSCs) reçues par les neurones hiPSC dérivés à différents jours après différenciation. J. Fréquence des courants postsynaptiques excitateurs au cours du développement. K. Amplitude des courants postsynaptiques excitateurs au cours du développement. L. Représentant des traces d&#39;enregistrements RPEC sans (témoin) et avec CNQX (CNQX). M. Neurones dérivée d&#39;une ligne hiPSC ont été cultivées sur un MEA à 6 puits et l&#39; activité du réseau est représenté pour les réseaux neuronaux hiPSC dérivés 16 et 23 jours après l&#39;induction de la différenciation. L&#39;activité enregistrée à partir dechaque (taux d&#39;échantillonnage de 10 kHz) et est indiqué par une couleur différente (5 min de la 20 min d&#39;enregistrement sont représentés). N. taux de tir 16 et 23 jours après l&#39;induction de la différenciation. O. taux Débordant 16 et 23 jours après l&#39;induction de la différenciation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Compte tenu de ces résultats, la qualité des neurones hiPSC dérivé résultant peut être évaluée en faisant un profil neurophysiologique des cellules. Autrement dit, trois à quatre semaines après le début de la différenciation, de la morphologie, synapsine-1/2 expression et électrophysiologique des neurones peuvent être évalués. A ce point du temps, les neurones hiPSC dérivés devraient montrer une morphologie neuronale-like, pour être MAP2, synapsine / PSD-95 immunocytochimie lors de l&#39;exécution positive et à Exhibit l&#39;activité électrophysiologique spontanée (les deux à la seule cellule et au niveau du réseau).

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Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Nous modifions et mettre en œuvre un protocole précédemment publié décrivant la différenciation rapide, reproductible et efficace des humains induite par cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) dans les neurones corticaux excitateurs 12. Plus précisément, notre modification permet un contrôle de la densité des cellules neuronales et l&#39;utilisation sur des réseaux de micro-électrodes pour mesurer les propriétés électrophysiologiques au niveau du réseau.

Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l&#39;activité réseau sur Arrays Micro-électrode

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