Name: rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays at JoVE.com

The authors thank Jessica Classen for performing the whole-cell patch-clamp experiments. The hiPSCs used in our experiments were kindly provided by Huiqing Zhou and Willem van den Akker from the Radboud University Nijmegen. The transfer vectors used in this protocol were kindly provided by Oliver Br&#252;stle, Philipp Koch and Julia Ladewig from the University of Bonn Medical Centre.

<ol>
	<li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+human+disease+using+human+neurons.">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines.">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li><li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li><li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li><li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells:+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture.">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture.">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li><li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture.">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181 (2016).</li><li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays.">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li><li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro.">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li><li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays.">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li><li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tintur&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces.">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).</li><li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells:+a+quick+protocol.">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965 (2012).</li><li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function.">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li><li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer.">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li><li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function.">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li><li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling.">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures:+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology.">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489 (2014).</li><li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays:+an+innovative+in+vitro+experimental+model.">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Здесь мы внедрили эффективный протокол hiPSC-дифференциацию опубликованной Чжан и др. (2013) 12 для измерения сетевой активности hiPSC-производных нейронных сетей на МЭС. Мы адаптировали оригинальный протокол путем создания rtTA / Ngn2 -положительным hiPSC линию до индукции дифференцировки нейронов. Этот дополнительный шаг позволяет контролировать нейронную плотность клеток на СМЭ. Контроль за плотности нейронов была важной предпосылкой для адаптации протокола к МЭС и для обеспечения согласованности. Для измерения активности нейронных сетей с использованием МЭС, нейроны должны образовывать плотные сети непосредственно поверх МЭС электродов 17,18. Это неизбежно требует жесткого контроля над плотностью металлизации нейронов. RtTA / Ngn2 -положительным hiPSC линия позволяет контролировать плотность нейронов , так как эта тактика не зависит от острых лентивирусов hiPSCs из каскадов , до дифференциации;поэтому rtTA / Ngn2 -положительным hiPSC линия практически исключает любое изменение конечного выхода из - за, например, лентивирусов токсичности и переменной эффективности инфекции. Другим важным шагом экспериментальной процедуры является количество астроцитов крыс, которые культивируют совместно с дифференцирующих hiPSCs. Астроциты активно содействовать уточнению развития нейронных цепей, контролируя образование синапсов, техническое обслуживание и устранение, все из которых являются важными процессами для функционирования нервных клеток. Протокол, представленные в этой статье, является весьма астроцитов-зависимой: полностью зрелой и формируют функциональные синапсы, нейроны требуют поддержки со стороны астроцитов. Мы испытали, что число астроцитов должно быть примерно равно числу hiPSC полученных из нейронов поддерживать созревание нейронов и образование нейронных сетей, обладающих спонтанной активностью. Так как наши урожаи протокола астроцитов первичных Кю клетоквания с ограниченным сроком службы, выделение астроцитов крыс должно проводиться на регулярной основе. Наша адаптация протокола , опубликованного Zhang и др. (2013) 12 для использования с MEA технологии, вероятно , значительно улучшить нашу способность изучать сетевую активность hiPSC-производных сетей. Ранее протоколы , используемые для изучения hiPSC полученных из нейронных сетей с МЭС полагались на затратных по времени процедур дифференциации 13-16. Протокол от Zhang и др. (2013) обеспечивает быструю альтернативу, и наша модификация устраняет источник изменчивости, что делает его в настоящее время более целесообразно использовать hiPSC-производные нейроны в сочетании с MEA технологии, особенно в высокой пропускной способности и фармакологических исследований. Кроме того, так как этот метод опубликован Zhang и др. (2013) 12 дает однородное население верхнего уровня корковых нейронов, наш адаптированный протокол делает возможным целенаправленные исследования в сети Activity этого конкретного нейронального подмножества. Тем не менее, этот подход также имеет ряд ограничений. Во- первых, гомогенность культур также можно считать недостатком, так как культуры, менее вероятно, напоминают в естественных условиях сетей, где различные классы нейронов (например , ингибирующих и возбуждающих нейронов) образуют гетерогенную сеть. Для дальнейшего повышения использования hiPSC полученных из нейронов с MEA технологии, это будет иметь важное значение для разработки быстрых (трансгенов) на основе протоколов дифференцировки для других популяций нейронов клеток. Если протоколы становятся доступными, сети в пробирке будет более тесно имитировать сети в естественных условиях. Во- вторых, в настоящее время астроцитов крысы должны быть добавлены к hiPSC полученных из нейронов для поддержки роста, и , следовательно, в результате чего нейронной сети не является человеческой нейронной сети в буквальном смысле. Надежные протоколы для дифференциации hiPSCs в астроциты могут в будущем золеве этой проблемы 26. В- третьих, двумерные нейронных сетей, как описано здесь, являются ограниченная модель для изучения сложных трехмерных в естественных нейронных сетей. К счастью, протоколы , описывающие трехмерные культуры крысы первичных нейронов в сочетании с MEA технологии уже доступны 27,28. Проспективно, сочетание быстрых протоколов дифференциации для получения hiPSC полученных из нейронов и астроцитов с трехмерными методами культивирования и технологии MEA должны обеспечить новое понимание биологических механизмов, лежащих в основе неврологических расстройств.

Развитие человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) протоколов дифференцировки для формирования человека нейроны в пробирке дала мощный новый инструмент для изучения неврологических расстройств. До недавнего времени изучение этих нарушений не было сильно затруднено из-за отсутствия модельных систем с использованием человеческих нейронов. Хотя грызуны могут быть использованы для изучения неврологических расстройств, результаты таких исследований не могут быть легко переведены на человека 1. Принимая во внимание эти ограничения, hiPSC-производные нейроны являются перспективной альтернативой модель , которая может быть использована для выяснения молекулярных механизмов , лежащих в основе неврологических расстройств и для экстракорпорального скрининга лекарственных средств. В последнее десятилетие, несколько протоколов для преобразования hiPSCs в нейроны были разработаны 2-8. Тем не менее, эти протоколы все еще ограничены во многих отношениях. Во- первых, протоколы зачастую отнимает много времени: генерирующие нейроны с адекватной созревания (т.е. synapформирование таковой) и функциональной активности требует месяцев процедур культивирования, что делает крупномасштабные исследования сложных 9. Кроме того, эффективность преобразования hiPSC к нейрону является низким. Протоколы часто приводят к гетерогенную популяцию нейронов, и, таким образом, не позволяют исследования конкретных подмножеств нейрональных клеток. Кроме того, протоколы не являются воспроизводимыми, что дает различные результаты для различных линий IPSC 10,11. И, наконец, этап созревания и функциональные свойства полученных нейронов также различны 10. Для решения этих проблем, Чжан и др. (2013) 12 разработала протокол , который быстро и воспроизводимо генерирует человеческие нейроны от hiPSCs по гиперэкспрессией фактор транскрипции neurogenin-2. Как сообщают авторы, дифференциация происходит относительно быстро (всего 2 - 3 недели после индукции экспрессии neurogenin-2), протокол является воспроизводимым (нейронные свойства не зависят от хtarting hiPSC линия), а также преобразование hiPSC к нейрону высокоэффективен (почти 100%). Популяция нейронов, полученных с их протоколом однородна (напоминающая верхнего уровня корковых нейронов), что позволяет исследовать камерного типа конкретных вкладов в нейронных нарушений. Кроме того, их hiPSC-производные нейроны выставлялись зрелые свойства (например, способность формировать синапсы и надежную функциональную активность) после того, как только 20 д. Характеризуя электрофизиологические свойства hiPSC-нейронов, полученных на сетевом уровне является важной предпосылкой, прежде чем технологии hiPSC могут быть использованы для изучения заболеваний человека. По этой причине, многие исследовательские группы недавно начали изучать стволовых клеток , полученных из нейронов на сетевом уровне с использованием микро-матрицы электродов (MEA) устройства (многоканальные системы, Reutlingen, Германия) 13-16. Электроды МПОС встроены в подложку, на которой можно культивировать нейрональные клетки.МЭС могут быть использованы для изучения электрофизиологических свойств нейронных сетей и развитие экстракорпоральное их активности. В настоящее время МЭС используются только в сочетании с дифференциацией протоколами, которые принимают несколько месяцев для получения зрелых сетей. Следовательно, объединение МЭС с быстрым протоколом дифференциации должно облегчить использование этой технологии в крупномасштабных исследованиях неврологических расстройств. Здесь мы представляем модификацию Zhang и др. (2013) 12 протокола и адаптировать его для использования на МЭС. В частности, вместо того , чтобы полагаться на острый лентивирусов трансдукции, мы вместо того, чтобы создали hiPSC линии , стабильно экспрессирующие rtTA / Ngn2 перед тем индукции дифференцировки. Мы сделали это в первую очередь , чтобы иметь воспроизводимые контроль над плотностью нейрональных клеток, так как нейронная плотность клеток имеет решающее значение для формирования нейронной сети, а также для хорошего контакта между нейронами и электродами МЭС 17,18. Althougч Чжан и др. Протокол является очень эффективным в отношении конверсии трансдуцированных hiPSCs, он по своей природе переменной по отношению к конечному выходу нейронов из числа hiPSCs гальваническим первоначально (рис 2E в Zhang и др.) 12. При стабильной линии, мы исключаем много вопросов, вызывающих изменчивость, таких как лентивирусов токсичность и эффективность инфекции. Затем мы оптимизировали параметры , которые надежно производить hiPSC полученных из нейронных сетей на МЭС, получение сети созреванию (например, синхронные события с участием большинства каналов) на третьей неделе. Этот быстрый и надежный протокол должен позволить проводить прямые сравнения между нейронами , полученных из различных (т.е. специфическая для пациента) линий hiPSC, а также обеспечивают надежную последовательность для фармакологических исследований.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="805">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lebovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11415-064</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">0080085SA</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P6407</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ca2+/Mg2+-free HBSS&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14175-095</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">0.05 % Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">2.5 % Trypsin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">15090-046</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">High-glucose DMEM</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">FBS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">F2442-500ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P4333</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:99px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:180px;">352350</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DPBS</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14190-094</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">psPAX2 lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12260</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">pMD2.G lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12259</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1413201</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11320-074</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">A6964</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">E8 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1517001</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A2644501&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Polybrene</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">H9268-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">G418</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">G8168-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Puromycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P9620-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Vitronectin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A14700</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">6-well MEAs</td>
			<td style="width:99px;">Multi Channel Systems</td>
			<td style="width:180px;">60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">631-0899</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P3655-10MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Laminin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">L2020-1MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Doxycyclin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D9891-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">17502-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">M7145</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">NT-3, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66425</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">BDNF, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66212</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">35050-038</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">21103-049</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">C1768-100MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Straight fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">11251</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fine-tipped spring scissors&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">91500-09</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays

Нейроны, полученные из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) обеспечивают новый перспективный инструмент для изучения неврологических расстройств. В последнее десятилетие были разработаны многие протоколы для дифференциации hiPSCs в нейроны. Тем не менее, эти протоколы часто медленно с высокой изменчивостью, низкой воспроизводимостью и низкой эффективностью. Кроме того, нейроны, полученные с помощью этих протоколов часто незрелые и не имеют надлежащей функциональной активности как на одноклеточных и сетевых уровней, если нейроны не культивируют в течение нескольких месяцев. Частично из-за этих ограничений, функциональные свойства hiPSC-производных нейронных сетей все еще недостаточно хорошо охарактеризованы. Здесь мы приспосабливаемся недавно опубликованный протокол , который описывает производство человеческих нейронов из hiPSCs форсированным экспрессии фактора транскрипции neurogenin-2 12. Этот протокол быстрый (дающим зрелых нейронов в течение 3-х недель) и эффективно, с эффективностью преобразования почти 100% transducе изд клетки (&gt; 95% от DAPI-положительных клеток являются МАР2 положительными). Кроме того, протокол дает гомогенную популяцию возбуждающих нейронов, которые позволили бы исследование камерного типа конкретных вкладов в неврологических расстройств. Мы модифицировали исходный протокол, генерируя стабильно приемными клетками hiPSC, что дает нам явное управление общего количества нейронов. Эти клетки затем используются для генерации hiPSC полученных из нейронных сетей на микро-матриц электродов. Таким образом, спонтанное электрофизиологическое активность hiPSC-производных нейронных сетей может быть измерена и охарактеризована, сохраняя при этом interexperimental согласованность с точки зрения плотности клеток. Представленный протокол широко применим, особенно для механистических и фармакологических исследований на нейронных сетей человека.

Здесь мы успешно изменили протокол , в котором hiPSCs дифференцируются непосредственно в корковых нейронах сверхэкспресирующим фактор neurogenin-2 12 транскрипции и мы адаптировали его для использования МЭС. Такой подход является быстрым и эффективным позволяет нам получать функциональные нейроны и сетевую активность уже в течение третьей недели после индукции дифференциации. В ходе протокола дифференцировки клетки морфологически начали напоминать нейроны: образовывались небольшие процессы и нейроны стали подключать друг к другу (фиг.1А). Мы установили нейрофизиологическую профиль нейронов, полученных из hiPSC линии здорового управления, путем измерения их нейронную морфологию и синаптические свойства в процессе развития. hiPSC-производные нейроны окрашивали на МАР2 и синапсины-1/2, в разные дни после началадифференцирования (фиг.2А). Выведенные нейроны показывают зрелые нейрональные морфологию уже через 3 недели после индукции дифференцировки. Число синапсины-1/2 Puncta (мера для числа синапсов) количественно оценивали на основе синапсины-1/2 иммуноцитохимию окрашиванием. Число синапсины-1/2 Puncta увеличилось с течением времени, что свидетельствует о том , что уровень нейронального связности также возрастает (Фигура 2В). Число синапсины-1/2 Puncta 23 дней после индукции дифференциации была одинаковой в двух независимых линий IPS (рис 2С). На 23 ДИВ наиболее synapsin1 / 2 Puncta были сопоставлены с PSD-95 Puncta, что указывает на функциональные синапсы (рис 2D). В соответствии с результатами , описанными Zhang и др., Мы получили население возбуждающих верхнего уровня корковых нейронов, что подтверждается пан-нейронный и подтип-специфической корковой м<html> arkers, такие как BRN2 и SATB2 (слой II / III). Мы не наблюдали нейронов , которые были положительными для глубокого слоя нейронов CTIP2 (слой V) или FOXP2 (слой VI) (рис 2Е и F) Для того, чтобы охарактеризовать электрофизиологические активность hiPSC полученных из нейронов, мы использовали ток целой клетки и напряжения записи хомута, то есть внутренние свойства и возбуждающий вход на эти нейроны были измерены в процессе разработки. Нейроны были способны генерировать потенциалы действия уже через одну неделю после дифференциации и процент клеток наблюдаются пики увеличивалось с течением времени (рис 2G и H). Кроме того, нейроны получили возбуждающей синаптической вход уже через неделю после индукции дифференциации: как частота и амплитуда возбуждающей синаптической вход увеличился в процессе разработки (Рисунок 2I - K). нт &quot;ВОК: Keep-together.within-страницу =&quot; 1 &quot;&gt; Для того, чтобы лучше понять , как одноклеточные деятельность сочетает в виде функций сетевого уровня, необходимо изучить , как нейроны работают согласованно в условиях in vitro нейронных сетей культивировали на МЭС. представляют собой ценный экспериментальную модель для изучения нейронные динамики. Мы записали 20 мин электрофизиологических сетевой активности нейронов , полученных из hiPSC линии здорового управления культивируемых на 6-луночных МЭС (рис 2М). через несколько недель после индукции дифференцировки нейронов производным от здорового управления hiPSCs формируется функционально активных нейронных сетей, показывая спонтанные события (0,62 ± 0,05 шип / с; Рисунок 2а). на данном этапе развития (т.е. 16 d после начала дифференцировки) нет синхронных событий с участием всех каналов . МЭС обнаружены (рис 2О) уровень сетевой активности увеличился в процессе разработки: в течение четвертой недели после т<html> он индуцирование дифференцировки, нейронные сети , показали высокий уровень спонтанной активности (2,5 ± 0,1 спайка / с; Рисунок 2 н) во всех лунках устройства. В сети также выставляются синхронной сети очередей (4,1 ± 0,1 пачки импульсов / мин, рис 2O) с большой продолжительностью (2,100 ± 500 мс). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" /> Рисунок 1: hiPSC Дифференцировка в нейронах. A. Три временные точки hiPSCs дифференцировки в нейроны на покровные. B. Покрытие из hiPSCs на МЭС. С. астроциты при 100% сплошности в колбе T75 (обратите внимание , что клетки образуют мозаичную монослой). Шкала баров: 150 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> e_content &quot;ВОК: Keep-together.within-странице =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" /> Рисунок 2. hiPSC полученные нейронах характеристики. А. hiPSC-производные нейроны окрашивали на МАР2 (зеленый) и синапсины-1/2 (красный) в разные дни после начала дифференцировки. Шкала бар: 10 мкм. Б. Количественное синапсины Puncta в двух независимых экспериментах. В каждом экспериментах были проанализированы по крайней мере, 10 клеток. C. Количественная синапсины Puncta в DIV23 в нейронах , полученных из двух независимых линий IPS. D. hiPSC-производные нейроны окрашивали для PSD-95 (зеленый) и синапсины-1/2 (красный) 23 дня после начала дифференциации. Синапсины Puncta соседствуют с PSD-95 Puncta. E. hiPSC-производные нейроны окрашивали для MAP2 (зеленый) и BRN2 (красный) или SATB2 (красный) 23 г после начала дифференцировки. F. Процент map2 положительных клеток,были положительными для указанных маркеров. G. Типичные токовые клещи записи , показывающие , что потенциалы действия могут быть получены уже в 7 суток после начала дифференцировки. H. Процент клеток в разные дни после индукции дифференциации , которые показывают один или несколько потенциалов действия. I. Характерные следы возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs) , полученных hiPSC-нейронов , полученных в разные дни после дифференцировки. J. Частота возбуждающих постсинаптических токов в процессе разработки. К. Амплитуда возбуждающих постсинаптических токов в процессе разработки. L. Представитель следы записей EPSC без (контроля) и с CNQX (CNQX). М. Нейроны полученный из одной линии hiPSC культивировали на MEA 6-луночного и сетевую активность показана на hiPSC-производных нейронных сетей 16 и 23 дней , после индукции дифференцировки. Активности, регистрируемой изкаждый (скорость 10 кГц дискретизации) хорошо обозначена с другим цветом (5 мин от 20 мин записи показаны). Н. скорострельность 16 и 23 г после индукции дифференцировки. О. Скорость Разрывные 16 и 23 г после индукции дифференцировки. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> С учетом результатов, качество получаемых hiPSC полученных нейронов может быть оценена путем нейрофизиологической профиля клеток. То есть, в три-четыре недели после начала дифференцировки, морфологии,-1 синапсины / 2 экспрессии и электрофизиологических нейронов могут быть оценены. В этот момент времени, то hiPSC-производные нейроны, как ожидается, показывают нейронный морфологию, быть МАР2, синапсины / PSD-95 положительными при выполнении иммуноцитохимия, и exhibiт спонтанной электрофизиологических активности (как на одноклеточных и сетевом уровне).

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays at JoVE.com

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Мы модифицируем и реализовать ранее опубликованный протокол , описывающий быстрое, воспроизводимое и эффективное дифференцировку человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в возбуждающих корковых нейронов 12. В частности, наша модификация позволяет контролировать плотности нейронов и использования клеток на микро-матриц электродов для измерения электрофизиологических свойств на сетевом уровне.

Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Трафарет Micropatterning человеческих плюрипотентных стволовых клеток для исследования пространственной организации дифференциации Судеб

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Протокол дифференцирования индуцированных человеком стволовых клеток с плюрипотентными клетками в смешанные культуры нейронов и глии для тестирования нейротоксичности

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...