Name: rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays at JoVE.com

The authors thank Jessica Classen for performing the whole-cell patch-clamp experiments. The hiPSCs used in our experiments were kindly provided by Huiqing Zhou and Willem van den Akker from the Radboud University Nijmegen. The transfer vectors used in this protocol were kindly provided by Oliver Br&#252;stle, Philipp Koch and Julia Ladewig from the University of Bonn Medical Centre.

<ol>
	<li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+human+disease+using+human+neurons.">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines.">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li><li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li><li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li><li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells:+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture.">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture.">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li><li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture.">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181 (2016).</li><li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays.">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li><li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro.">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li><li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays.">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li><li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tintur&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces.">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).</li><li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells:+a+quick+protocol.">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965 (2012).</li><li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function.">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li><li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer.">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li><li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function.">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li><li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling.">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures:+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology.">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489 (2014).</li><li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays:+an+innovative+in+vitro+experimental+model.">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Här har vi genomfört en effektiv hiPSC-differentiering protokoll publicerats av Zhang et al. (2013) 12 för att mäta aktiviteten nätverk av hiPSC härledda neuronala nätverk på MEA. Vi anpassade ursprungliga protokollet genom att skapa en rtTA / Ngn2 -positivt hiPSC linje innan framkalla neuronal differentiering. Detta ytterligare steg ger oss möjlighet att kontrollera neuronala celltätheten på MEA. Kontroll över den neuronala densitet var en viktig förutsättning för att anpassa protokollet till MEA och för att säkerställa konsekvens. För att mäta aktiviteten av neuronala nätverk med MEA, nervceller måste bilda täta nätverk direkt ovanpå MEA elektroderna 17,18. Detta kräver nödvändigtvis strikt kontroll över plätering tätheten av nervceller. Få den rätta / Ngn2 -positivt hiPSC linje möjliggör styrning av neuron densitet eftersom denna taktik inte förlitar sig på akut lentivirala transduktioner av hiPSCs före differentiering;få den rätta / Ngn2 -positiv hiPSC linje därför nästan eliminerar varje variation i det slutliga utbytet på grund av, till exempel, lentivirala toxicitet och variabel infektionseffektivitet. Ett annat kritiskt steg av den experimentella proceduren är antalet av de rått astrocyter som samodlades med de differentierande hiPSCs. Astrocyter aktivt bidra till förfining av att utveckla nervbanor genom att styra synaps bildning, underhåll och eliminering, vilka alla är viktiga processer för neuronal funktion. Protokollet presenteras i detta dokument är mycket astrocyternas beroende: att färdigutvecklat och bildar funktionella synapser, nervceller kräver stöd från astrocyter. Vi upplevde att antalet astrocyter bör vara ungefär lika med antalet hiPSC-härledda neuroner för att stödja mognaden av neuronerna och bildningen av neuronala nätverk som uppvisar spontan aktivitet. Eftersom våra astrocyternas protokoll utbyten primär cell culturer med en begränsad livslängd, har isoleringen av rått astrocyter som skall utföras regelbundet. Vår anpassning av protokollet publicerats av Zhang et al. (2013) 12 för användning med MEA teknik kommer sannolikt avsevärt förbättra vår förmåga att studera aktiviteten nätverk av hiPSC-härledda nätverk. Tidigare protokoll som används för att studera hiPSC-härledda neuronala nätverk med MEA förlitat sig på tidsödande differentieringsförfaranden 13-16. Protokollet från Zhang et al. (2013) ger en snabb alternativ, och vår modifiering avlägsnar en källa till variabilitet, vilket gör det nu mer lämpligt att använda hiPSC-härledda neuroner i kombination med MEA teknik, särskilt i hög genomströmning eller farmakologiska studier. Dessutom, eftersom den metod som publicerats av Zhang et al. (2013) 12 ger en homogen population av övre skikt kortikala neuroner, gör vår anpassade protokoll möjliga fokuserade studier i nätverket enctivity av denna särskilda neuronala delmängden. Icke desto mindre har denna strategi också flera begränsningar. För det första kan homogenitet kulturerna också betraktas som en nackdel, eftersom kulturer är mindre benägna att likna in vivo nätverk, där olika typer av neuroner (dvs hämmande och excitatoriska neuroner) utgör en heterogen nätverk. För att ytterligare förbättra användningen av de hiPSC-härledda neuroner med MEA-teknik, kommer det att vara viktigt att utveckla snabba (transgen baserade) differentieringsprotokoll för andra neuronala cellpopulationer. Om protokollen blir tillgängliga, skulle in vitro nätverk härma in vivo nätverk närmare. För det andra, för närvarande rått astrocyter måste läggas till de hiPSC-härledda neuroner för tillväxt stöd, och därför den resulterande neuronala nätverket är inte en mänsklig neuronala nätverket egentlig bemärkelse. Pålitliga protokoll för differentiering hiPSCs i astrocyter kan i framtiden solve detta problem 26. För det tredje, tvådimensionella neuronala nätverk, som beskrivs här, är en begränsad modell för att studera komplexa tredimensionella in vivo neuronala nätverk. Lyckligtvis protokoll beskriver tredimensionella kulturer av råtta primära neuroner i kombination med MEA teknik finns redan tillgängliga 27,28. Framåtriktat, bör kombinationen av snabba differentieringsprotokoll för att erhålla hiPSC-härledda neuroner och astrocyter med tredimensionella odlingstekniker och MEA teknik ger nya insikter i de biologiska mekanismerna bakom neurologiska sjukdomar.

Utvecklingen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) differentieringsprotokoll för att generera humana neuroner in vitro har gett ett kraftfullt nytt verktyg för att studera neurologiska sjukdomar. Tills nyligen var studiet av dessa störningar försvåras avsevärt av avsaknaden av modellsystem med humana neuroner. Även gnagare kan användas för att studera neurologiska sjukdomar, kan resultaten av sådana studier inte översättas lätt för människor 1. Med tanke på dessa begränsningar, hiPSC härledda neuroner är ett lovande alternativ modell som kan användas för att belysa molekylära mekanismerna bakom neurologiska sjukdomar och för in vitro läkemedelsscreening. Under det senaste decenniet, flera protokoll konvertera hiPSCs i nervceller har utvecklats 2-8. Men dessa protokoll som fortfarande begränsad på många sätt. Först, protokollen är ofta tidskrävande: generera nervceller med tillräcklig mognad (dvs. synapse formation) och funktionella aktiviteten kräver månader av odlingsförfaranden, vilket gör storskaliga studier svåra 9. Dessutom är effektiviteten hiPSC-till-neuron omvandlingen låg. Protokoll ger ofta en heterogen population av nervceller, och därmed inte tillåter studier av specifika delmängder av nervceller. Dessutom protokollen är inte reproducerbara, vilket ger olika resultat för olika IPSC linjerna 10,11. Slutligen mognaden scenen och funktionella egenskaperna hos de resulterande nervceller är också variabel 10. För att ta itu med dessa problem, Zhang et al. (2013) 12 utvecklade ett protokoll som snabbt och reproducerbart genererar mänskliga nervceller från hiPSCs genom överuttryck transkriptionsfaktor neurogenin-2. Som rapporterats av författarna, sker differentieringen relativt snabbt (bara 2-3 veckor efter induktion av uttryck av neurogenin-2), är reproducerbar protokollet (neuronala egenskaper är oberoende av starting hiPSC linje), och den hiPSC-till-neuron konvertering är effektiv (nästan 100%). Befolkningen i nervceller genereras med deras protokoll är homogen (liknar övre skikt kortikala neuroner), vilket gör att utreda celltyp specifika bidrag till neuronala sjukdomar. Dessutom deras hiPSC-härledda neuroner uppvisade mogna egenskaper (t.ex. att förmågan att bilda synapser och robust funktionell aktivitet) efter bara 20 d. Karaktärisera elektrofysiologiska egenskaperna hos hiPSC-härledda neuroner på nätverksnivå är en viktig förutsättning innan hiPSC tekniken kan utnyttjas för studiet av mänskliga sjukdomar. Av denna anledning har många forskargrupper nyligen börjat undersöka stamcells-härledda neuroner på nätverksnivå med hjälp av mikroelektrodgrupp (MEA) enheter (multikanalsystem, Reutlingen, Tyskland) 13-16. Elektroderna i ett MEA är inbäddade i ett substrat på vilket neuronala celler kan odlas.MEA kan användas för att undersöka de elektrofysiologiska egenskaperna hos neuronala nätverk och in vitro utveckla sin verksamhet. För närvarande är MEA används endast i kombination med differentieringsprotokoll som tar flera månader för att ge mogna nätverk. Därför bör kombinera MEA med en snabb differentiering protokoll underlätta användningen av denna teknik i storskaliga studier av neurologiska sjukdomar. Här presenterar vi en modifiering av Zhang et al. (2013) 12 protokoll och anpassa den för användning på MEA. I synnerhet i stället för att förlita sig på en akut Lentiviral transduktion, istället har vi skapat hiPSC linjer som stabilt uttrycker rtTA / Ngn2 innan inducera differentiering. Vi gjorde detta i första hand att ha reproducerbar kontroll över den neuronala celltäthet, eftersom nervcelltätheten är avgörande för neuronal nätverksbildning, och för god kontakt mellan nervceller och elektroderna MEA 17,18. although Zhang et al. protokollet är mycket effektiv med avseende på omvandling av transducerade hiPSCs, är det i sig variabel med avseende på den slutliga utbytet av neuroner från antalet hiPSCs pläterade initialt (se figur 2E i Zhang et al.) 12. Med en stabil linje, vi eliminera många frågor som orsakar variation, såsom lentivirala toxicitet och infektionseffektivitet. Vi optimerade då de parametrar som på ett tillförlitligt sätt ger hiPSC-härledda neuronala nätverk på MEA, få nätverk mognad (t.ex. synkrona händelser med en majoritet av kanalerna) av den tredje veckan. Denna snabba och tillförlitliga protokoll bör möjliggöra direkta jämförelser mellan nervceller som härrör från olika (dvs patientspecifika) hiPSC linjer samt ger robust konsistens för farmakologiska studier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="805">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lebovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11415-064</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">0080085SA</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P6407</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ca2+/Mg2+-free HBSS&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14175-095</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">0.05 % Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">2.5 % Trypsin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">15090-046</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">High-glucose DMEM</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">FBS</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">F2442-500ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P4333</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:99px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:180px;">352350</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DPBS</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">14190-094</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">psPAX2 lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12260</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">pMD2.G lentiviral packaging vector</td>
			<td style="width:99px;">Addgene</td>
			<td style="width:180px;">Plasmid #12259</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1413201</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">11320-074</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">A6964</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">E8 medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A1517001</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A2644501&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Polybrene</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">H9268-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">G418</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">G8168-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Puromycin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P9620-10ML</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Vitronectin</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">A14700</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">6-well MEAs</td>
			<td style="width:99px;">Multi Channel Systems</td>
			<td style="width:180px;">60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">631-0899</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P3655-10MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Laminin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">L2020-1MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Doxycyclin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D9891-5G</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">N-2 supplement</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">17502-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">M7145</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">NT-3, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66425</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">BDNF, human recombinant</td>
			<td style="width:99px;">Promokine</td>
			<td style="width:180px;">C66212</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">25300-054</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">35050-038</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:99px;">Gibco</td>
			<td style="width:180px;">21103-049</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">C1768-100MG</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Straight fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">11251</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fine-tipped spring scissors&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:180px;">91500-09</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid neuronal differentiation of induced pluripotent stem cells for measuring network activity on micro-electrode arrays

Neuroner som härrör från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) ger ett lovande nytt verktyg för att studera neurologiska sjukdomar. Under det senaste decenniet har många protokoll för differentiering hiPSCs till neuroner utvecklats. Men dessa protokoll är ofta långsamma med hög variabilitet låg reproducerbarhet, och låg effektivitet. Dessutom nervceller som erhållits med dessa protokoll är ofta omogna och saknar adekvat funktionell aktivitet både på encelliga och nätverksnivå om nervceller odlas i flera månader. Delvis på grund av dessa begränsningar, de funktionella egenskaperna hos hiPSC-härledda neuronala nätverk är fortfarande inte väl karakteriserade. Här anpassar vi en nyligen publicerad protokoll som beskriver produktion av humana neuroner från hiPSCs genom forcerad expression av transkriptionsfaktorn neurogenin-2 12. Detta protokoll är snabb (vilket ger mogna nervceller inom 3 veckor) och effektiv, med nästan 100% effektivitet transduc omvandlingsed-celler (&gt; 95% av DAPI-positiva celler är MAP2-positiva). Dessutom ger protokollet en homogen population av excitatoriska neuroner som skulle göra det möjligt att utreda celltyp specifika bidrag till neurologiska sjukdomar. Vi ändrade det ursprungliga protokollet genom att generera stabilt transducerade hiPSC celler, vilket ger oss explicit kontroll över det totala antalet neuroner. Dessa celler används sedan för att generera hiPSC-härledda neuronala nätverk på mikro-elektrodgrupperna. På detta sätt kan den spontana elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-härledda neuronala nätverk mätas och karakteriserats, men behåller interexperimental konsistens i termer av celldensitet. Den presenterade protokollet är brett tillämpbar, i synnerhet för mekanistiska och farmakologiska studier på humana neuronala nätverk.

Här har vi framgångsrikt ändrat ett protokoll där hiPSCs differentieras direkt i kortikala neuroner genom överuttryck av transkriptionsfaktorn neurogenin-2 12 och vi har anpassat den för användning av MEA. Detta tillvägagångssätt är snabb och effektiv att tillåta oss att få funktionella nervceller och nätverksaktivitet redan under den tredje veckan efter induktion av differentiering. Under differentiering protokollet cellerna började morfologiskt att likna neuroner: små processer bildades och nervceller började ansluta till varandra (Figur 1A). Vi etablerade en neurofysiologisk profil av nervceller som härrör från en frisk kontroll hiPSC linje, genom att mäta deras neuronala morfologi och synaptiska egenskaper under utveckling. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 och synapsin-1/2 vid olika dagar efter startenav differentiering (Figur 2A). De härledda neuroner visar mogna neuronal morfologi redan 3 veckor efter induktion av differentiering. Antalet synapsin-1/2 puncta (ett mått för antalet synapser) kvantifierades baserat på synapsin-1/2 Immuncytokemi färgningar. Antalet synapsin-1/2 puncta ökade med tiden, vilket tyder på att nivån av nervkopplingar också ökar (Figur 2B). Antalet synapsin-1/2 puncta 23 dagar efter induktion av differentiering var liknande i två oberoende IPS linjer (figur 2C). Vid 23 DIV mest synapsin1 / 2 puncta var placerad intill PSD-95 puncta, som är indikativ för funktionella synapser (figur 2D). I överensstämmelse med de resultat som beskrivs av Zhang et al., Genererade vi en population av excitatoriska övre skikt kortikala neuroner, vilket bekräftas av pan-neuronala och subtyp specifika kortikal m<html> arkers såsom BRN2 och SATB2 (skiktet II / III). Vi observerade inte nervceller som var positiva för djup skikt neuroner CTIP2 (lager V) eller FOXP2 (skikt VI) (Figur 2E och F) För att karakterisera den elektrofysiologiska aktiviteten hos hiPSC-härledda neuroner, använde vi helcells-ström- och spännings klämma inspelningar, dvs inneboende egenskaper och excitatoriska ingång på dessa neuroner mättes under utveckling. Neuronerna var i stånd att alstra aktionspotentialer redan en vecka efter av differentiering och procentandelen spiking celler ökat över tiden (figur 2G och H). Dessutom fick nervceller excitatoriska synaptiska input redan en vecka efter induktion av differentiering: både frekvens och amplitud av den excitatoriska synaptiska ingång ökade under utveckling (Figur 2I - K). nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; För att bättre förstå hur encelliga aktivitet kombinerar att bilda nätverk nivå funktioner, är det viktigt att studera hur nervceller fungerar i samförstånd In vitro neuronala nätverk odlade på MEA. utgöra ett värdefullt experimentell modell för att studera neuronala dynamik. Vi spelade 20 minuter av elektronätverksaktivitet av neuroner som härrör från en frisk kontroll hiPSC linje odlas på 6 brunnar MEA (Figur 2M). Några veckor efter induktion av differentiering, nervceller härrör från friska kontroll hiPSCs bildade funktionellt aktiva neuronala nätverk, visar spontana händelser (0,62 ± 0,05 spik / s; Figur 2N). i detta skede av utvecklingen (dvs. 16 d efter starten av differentiering) inga synkrona händelser som involverar alla kanaler . av MEA detekteras (figur 2O) nivån på nätverksaktivitet ökade under utveckling: under den fjärde veckan efter t<html> han induktion av differentiering, visade neuronala nätverk hög spontan aktivitet (2,5 ± 0,1 spik / s, Figur 2N) i alla brunnar i enheten. De nätverk också uppvisade synkrona nätverks skurar (4,1 ± 0,1 brast / min, figur 2O) med lång varaktighet (2100 ± 500 ms). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" /> Figur 1: hiPSC differentiering till nervceller. A. Tre tidpunkter av hiPSCs differentiering till neuroner på täck. B. plätering av hiPSCs på MEA. C. Astrocyter på 100% konfluens i T75-kolv (observera att cellerna bildar en mosaikmonolager). Skalstrecken: 150 | im. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" /> Figur 2. hiPSC-härledda neuroner Characterization. A. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 (grön) och synapsin-1/2 (röd) vid olika dagar efter starten av differentiering. Skala bar: 10 pm. B. Kvantifiering av synapsin puncta i två oberoende experiment. I varje experiment minst 10 celler analyserades. C. Kvantifiering av synapsin puncta vid DIV23 i neuroner härledda från två oberoende IPS linjer. D. hiPSC-härledda neuroner färgades för PSD-95 (grön) och synapsin-1/2 (röd) 23 dagar efter starten av differentiering. Synapsin puncta är placerad intill PSD-95 puncta. E. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 (grön) och BRN2 (röd) eller SATB2 (röd) 23 d efter starten av differentiering. F. Procent av MAP2-positiva celler somvar positiva för indikerade markörer. G. Representativa Tång inspelningar som visar att aktionspotentialer kan genereras så tidigt som 7 d efter starten av differentiering. H. Andel av celler vid olika dagar efter induktion av differentiering som visar en eller flera aktionspotentialer. I. Representativa spår av excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) tas emot av hiPSC-härledda nervceller vid olika dagar efter differentiering. J. Frekvens av excitatoriska postsynaptiska strömmar under utveckling. K. amplitud av excitatoriska postsynaptiska strömmar under utveckling. L. representant spår av epsc inspelningar utan (kontroll) och med CNQX (CNQX). M. Neuroner härledd från en hiPSC linje odlades på en 6-brunnars MEA och nätverksaktivitet visas för hiPSC-härledda neuronala nätverk 16 och 23 d efter induktion av differentiering. Aktiviteten registrerades frånvarje brunn (samplingshastighet på 10 kHz) anges med en annan färg (5 minuter av 20 min av inspelningen är visade). N. eldhastighet 16 och 23 d efter induktion av differentiering. O. Bristning hastighet 16 och 23 d efter induktion av differentiering. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Mot bakgrund av resultaten, kan bedömas kvaliteten på de resulterande hiPSC härledda neuron genom att göra en neurofysiologisk profil av cellerna. Det vill säga tre till fyra veckor efter starten av differentiering, morfologin, synapsin-1/2-uttryck och elektrofysiologi av neuronerna kan bedömas. Vid denna tidpunkt, är hiPSC-härledda neuroner väntas visa en neuronal-liknande morfologi, att vara MAP2, synapsin / PSD-95 positiva när de utför immuncytokemi, och utställningent spontan elektrofysiologiska aktivitet (både på encelliga och nätverksnivå).

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays at JoVE.com

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Vi ändrar och genomföra ett tidigare publicerat protokoll beskriver snabb, reproducerbar och effektiv differentiering av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) till excitatoriska kortikala neuroner 12. Specifikt gör att våra modifikation kontroll av neuronal celltäthet och användning på mikroelektrodanordningar för att mäta elektrofysiologiska egenskaper på nätverksnivå.

Snabb neuronal differentiering av inducerade pluripotenta stamceller för att mäta nätverksaktivitet på Micro-elektrod arrayer

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat inkapsling av pluripotenta stamceller med hjälp av en Co-axial munstycke

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning av mänskliga pluripotenta stamceller för undersökning fysisk planering av differentiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokoll för differentieringen av humant inducerade plöripotenta stamceller i blandade kulturer av neuroner och Glia för neurotoxicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...