Name: spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.

<ol>
	<li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li><li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK/MAPK.">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+RTK-Ras-ERK+signaling+and+related+alternative+pathways.">Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways.</a> WormBook. , 1-38 (2013).</li><li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+apoptosis:+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer.">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li><li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis:+an+additional+case+report.">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li><li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+specificity:+the+right+place+at+the+right+time.">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li><li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pfeiffer+syndrome.">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).</li><li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells.">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li><li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling:+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li><li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling.">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li><li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li><li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis.">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li><li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation.">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li><li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation.">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li><li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade,+mek-2,+mpk-1/sur-1+and+let-60+ras,+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li><li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gonad:+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology.">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module.">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development.">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li><li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline.">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li><li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gld-1,+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans.">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li><li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster.">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li></ol>

The authors declared that no competing interests exist.

إرك النشط (dpERK) يتبع المكاني وديناميكية نمط التعريب النمطية في C. ايليجانس سلالة الجرثومية. هذه النمطية dpERK النمط المكاني (الشكل 5)، والسعة في مرحلة البلوغ C. ايليجانس الغدد التناسلية، ويمكن أن تكون مرتبطة بشكل فعال مع العديد من العمليات البيولوجية التي تنظم إرك. على سبيل المثال، عدم القدرة على تفعيل إرك في المنطقة 2 النتائج في الاعتقال في البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي، النمط الظاهري لوحظ في germlines الإناث التي لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لم تقم بتنشيط إرك في البويضات الناضجة (الشكل 5). التزاوج مع نتائج الذكور في تراكم الفعال للdpERK في المنطقة 2 في germlines الإناث 11،13، إلى جانب ظهور نضوج البويضة والإباضة. وهكذا تحليل الأنماط المكانية والزمانية تفعيل من dpERK على بعض الاضطرابات الوراثية (مثل تدخل الجيش الملكي النيبالي تثبيط الجين بوساطة) أو العلاجات الكيميائية يسمح لتحديد العوامل التي reguأواخر إشارات إرك والعمليات البيولوجية وبالتالي إرك التي تعتمد على. هذه التحليلات أيضا تمكين اكتشاف التفاعلات وراثية جديدة بين مسارات إشارات. وعنق الزجاجة للأي تحليل التصوير القائم هو توافر الكواشف وظيفية مثل الأجسام المضادة التي تخص التطبيق. في حالة وجود مثل هذا كاشف ثم طرق مثل تلك المذكورة أعلاه يمكن أن تتكيف بسهولة لتحليل نمط التعريب لأي بروتين من الفائدة. وبالتالي يحد من الطلب من قبل توافر الأجسام المضادة عمل. بالإضافة إلى ذلك، لأن أسلوب يصف تشريح وتلطيخ في وقت تنموي معين، لا يمكننا إلا التقاط المعلومات في إطار زمني واحد، ولا تسليط الضوء على ديناميات أو تنظيم البروتين في الوقت الحقيقي أو معدل دوران البروتين. ويتم تكييف الطريقة الموصوفة أعلاه من فرانسيس وآخرون. 23، والذي يختلف من سيدو ودان مethod 24 البثق الغدد التناسلية وتلوين الأجسام المضادة. وسوف يطلق على الأسلوب على أساس فرانسيس وآخرون. &quot;طريقة تعليق&quot; وطريقة سيدو ودان يسمى &quot;تجميد تكسير طريقة&quot; للمقارنة. وكانت طريقة تعليق فعالة جدا في أيدينا للحصول على أنماط توطين استنساخه من الجزيئات مما يشير مثل dpERK، التي هي بطبيعتها أكثر حساسية لظروف معالجة قاسية. في حالة dpERK التعريب، في تجربتنا، والإشارة في منطقة 1 غير قابل للكشف عمليا مع أسلوب تجميد تكسير. بالإضافة إلى ذلك، عينة التجفيف، والتي يمكن أن تحدث في كثير من الأحيان مع طريقة التجميد تكسير، والنتائج في إشارات الأجسام المضادة زائفة. طريقة تعليق يقلل عينة التجفيف، حيث يتم تعليق الغدد التناسلية في السائل طوال العملية. نجد أيضا أن الطريقة تعليق مفيد لتصوير متعددة الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة. على سبيل المثال، إذا كان اثنان المورثات، مثل المنحرفين مقابلالإناث إلى أن مباشرة مقارنة لdpERK التوطين، والمورثات اثنين يمكن أن تكون مختلطة معا ومعالجتها. وهذا ممكن لأن الظواهر تختلف ويمكن تمييزها عن طريق الأشكال التضاريسية دابي. تلطيخ في نفس أنبوب تليها التصوير على نفس الشريحة يسمح للمقارنة مباشرة بين الغدد التناسلية من المورثات مختلفة. بدلا من ذلك، إذا كانت الأشكال التضاريسية دابي ليست مميزة، ثم على بعد خطوتين تلوين الأجسام المضادة يمكن اعتمادها. لأول مرة يتم التعامل مع كل الوراثي الفردي مع اثنين من الأجسام المضادة متميزة، الجسم المضاد ألف لWT والجسم المضاد B لمتحولة (سواء الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تثار في مجموعة متميزة من الأجسام المضادة dpERK). مرة واحدة وقد تم ملطخة المورثات مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية، وغسلها، وأنها يمكن أن تكون مختلطة معا في أنبوب واحد وملطخة الآن مع الأجسام المضادة dpERK، تليها علاج الأجسام المضادة الثانوية إلى تصور كل الأجسام المضادة في الأنبوب. القدرة على المقارنة بين الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة، وخصوصا عندما دوتبذل eductions من أنماط تنشيط يضمن تفسيرات دقيقة لا يتأثر الظروف تلطيخ متميزة. في حين مفيد، وهناك خطوات متعددة في جميع أنحاء طريقة تعليق تتطلب المعالجة المتأنية. ومن الأهمية بمكان أن تحدث تشريح في الوقت بكفاءة. الأهم من ذلك، ينبغي أن تشريح لا تأخذ أكثر من 5 دقائق. مرات تشريح الأطول تؤدي في إشارة dpERK المتغيرة، التي غالبا ما يساء فهمها على أنها تغييرات ينظم في تفعيل إرك، وليس الفشل كما الفنية. ومن الأهمية بمكان أن تبدأ مع أكثر من 100-150 الحيوانات لكل تشريح لجميع أنحاء غسل مختلف الخطوات التي يمكن بسهولة الغدد التناسلية تضيع من الأنابيب بسبب أخطاء pipetting ل. فقدان الغدد التناسلية يمكن تخفيض إما عن طريق تشريح في دفعات صغيرة متعددة (مثل ثلاث دفعات من 50 الحيوانات لكل منهما) التي يمكن دمجها، أو عن طريق تشريح دفعة واحدة كبيرة من 150. وهناك تحد آخر هو الحصول على الغدد التناسلية للكذب في-متباعدة بشكل جيد تشكيلعلى الشريحة بحيث الغدد التناسلية البعيدة بأكمله ولا يمكن تصوير. لتمكين هذا، استخدم رمش على عود ثقاب أو ماصة سحبت إلى الفضاء خارج الغدد التناسلية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر حتى لا تتلف الغدد التناسلية أثناء هذه العملية. في كثير من الأحيان مع هذه التقنيات يستغرق عدة محاولات السيطرة على تشريح وكذلك الترتيبات من الغدد التناسلية على الشرائح. بمجرد يتقن هذه التقنية، وهي بمثابة وسيلة قوية للتحاليل البيولوجية المتنوعة، ويمكن استخدامها لدراسة أكثر من مستويات dpERK فقط. على سبيل المثال هذه الطريقة يمكن استخدامها لتصور مستويات النشطة P38، أو مستويات معلمين النشطة، أو أي البروتين الذي يوجد كاشف الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقترن الأسلوب مع شاشة تثبيط الكيميائية في الحيوانات كلها لفحص لمثبطات جديدة أو تفعيل للمسار، عبر يعاير لمستويات dpERK. وهذا سوف يسمح لقراءات في الجسم الحي من كل من رد الفعل والحساسية تجاه أي من مثبطات التي قد كثافة العملياتeract مع إشارات الطريق RTK-RAS-إرك. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في تركيبات الأجسام المضادة مع مخرجات الإشارات المتعددة التي يمكن لجميع استخدامها، وتصور في وقت واحد. باستخدام الأجسام المضادة متعددة يسمح ارتباط بين مسارات متعددة، وحالة تفعيلها، ونتائج كل داخل الأنسجة نفسها، مما يتيح فهم أفضل لهذه التفاعلات. هذه ليست سوى أمثلة قليلة على مزيد من التطبيقات لهذه الطريقة، ولكن هذا النظام يمكن تعديلها لدراسة اهتمامات بحثية متعددة.

ومستقبلات التيروزين كيناز (RTK) -RAt اللحمي (RAS) -Extracellular إشارة ينظم كيناز (إرك) مسار التتابع إشارات خارج الخلية من خلال سلسلة كيناز الحفظ الذي ينتج في الفسفرة وتفعيل إرك 1-3. البروتينات إرك أعضاء في الموجه البرولين الحفظ سيرين / ثريونين MAP (Mitogen المنشط البروتين) عائلة كيناز، وتفعيلها مباشرة من قبل منظمة مجاهدي خلق عبر الفسفرة المزدوجة على ثريونين (T) والتيروزين (Y) من عزر TEY محفوظ. إرك نشط (المشار إليها باسم diphosphorylated إرك، أو dpERK) ثم ينظم العديد من العمليات الخلوية والتنموية من خلال الفسفرة للبطارية من ركائز المصب 1-3. وهكذا النشاط إرك غير طبيعي يؤدي إلى العديد من الخلايا والعيوب التنموية 4-7. تنظيم صارم من النشاط إرك هو أمر حاسم لتنمية العادية: في أنظمة الثدييات الكثير من النشاط إرك يؤدي إلى الإفراط الرائدة انتشار الخليويإلى نمو أنكجنيك. النشاط القليل جدا يؤدي إلى موت الخلايا 4،6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في مدة النشاط إرك يؤدي أيضا إلى نتائج مختلفة: في الخلايا PC12، وتفعيل إرك لمدة 30 دقيقة أو أقل الحث تكاثر الخلايا، ولكن تفعيل إرك لمدة 60 دقيقة أو أكثر الحث تمايز الخلايا العصبية 8،9. تنظيم محكم من النشاط إرك وبالتالي من الضروري بشكل واضح عن التطور الطبيعي والتوازن. C. ايليجانس هي قوية، ومرن وراثيا نظام نموذجي لتشريح وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير مسار 3،10-15. بالنسبة لأنظمة الثدييات، والتي تحتوي على جينات متعددة لRAS وإرك، C. يحتوي ايليجانس جين واحد RAS (السماح-60) والجينات إرك واحد (MPK - 1)، مما يجعله نظاما وراثيا أكثر سطحي التي لتشريح وظيفة هذا المسار 3،10-14. وC. ايليجانس الخط الجرثومي هو في الأساس الأنبوب الذي يتكون من الإنقساميةالخلايا الجذعية في نهايته البعيدة والبويضات الناضجة في نهاية القريبة لها (الشكل 1) 16. الخلايا الجرثومية الشروع الانقسام الاختزالي فقط القريبة إلى منطقة الإنقسامية البعيدة، والتقدم من خلال الطور التمهيدي الموسع الانتصافي (طور التثخن)، وبعد ذلك البدء في تشكيل البويضات في المنطقة حلقة، تمر أخيرا بويضة النضوج في المنطقة القريبة 16. وقد أظهرت الدراسات الجينية من مختبرات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، أن مسار RTK-RAS-إرك أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية في C. ايليجانس 12،13،15،17-19. على وجه التحديد، وجدنا أن الضوابط إرك وينسق لا يقل عن تسعة العمليات البيولوجية متميزة خلال تطوير سلالة الجرثومية، بدءا من مفاتيح التنموية مثل جرثومة خلية موت الخلايا المبرمج للخلية العمليات البيولوجية مثل 11،18 نمو البويضة. يشبه إلى حد كبير في أنظمة الثدييات، والكثير من النشاط إرك في C. ايليجانس النتائج سلالة الجرثومية في إنتاج البويضات صغيرة متعددة، في حين لى أيضانتائج النشاط ttle في واحدة بويضة كبيرة (11). وبالتالي تنظيم محكم من dpERK أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية الطبيعية. النموذج النشط من إرك، كما تصور من قبل الأجسام المضادة المحددة لdpERK، يعرض النمطية، ودينامية، النسقين نمط التعريب: dpERK مرتفعة خلال منتصف طور التثخن (المنطقة 1، الشكل 1)، وانخفاض في المنطقة حلقة وارتفاع مرة أخرى في ناضجة البويضات (المنطقة 2، الشكل 1). مؤخرا، وجدنا أن التغذية تعمل من خلال عامل النمو الذي يشبه الانسولين مستقبلات 1 (داف-2) لتنشيط إرك في المنطقة 1 12؛ وأظهر العمل قبل أن إشارة الحيوانات المنوية (عبر Ephrin مستقبلات التيروزين كيناز) ينشط إرك في المنطقة 2 13. وبالنظر إلى أن وظائف إرك النشطة بمثابة مقاومة متغيرة في سلالة الجرثومية لتنظيم نمو البويضة، توطين المكاني والزماني، فضلا عن اتساع dpERK، هو المفتاح لفهم نتائج الإشارات العادية. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، والتغيرات فيتوطين النمطي للdpERK يمكن رصدها بسهولة والتنبؤات المستمدة من تأثير الاضطرابات البيئية أو الوراثية على النشاط إرك وبالتالي وظيفة. وهكذا، يعاير لdpERK يتيح فهم شامل لدورها خلال تطوير سلالة الجرثومية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:255px;">Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Flat bottom glass watch dish</td>
			<td style="width:159px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGL4161</td>
			<td style="width:255px;">We use glass, because dissected gonads often stick to plastic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">25 gauge needles</td>
			<td style="width:159px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes (could be 1 or 5 ml)</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringes</td>
			<td style="width:119px;">1 ml: BD 309659</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-343</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coverslips (24x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">2935-245</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">5ml glass conical tube</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8060-5</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9&#34; disposable Pasteur pipette</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Clinical bench top centrifuge</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glass&#160; tubes (6x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">14-958-A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">*M9 solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">3% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td style="width:119px;">17500</td>
			<td style="width:255px;">Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">**PBS</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1X PBST</td>
			<td style="width:159px;">1X PBS with 0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td>18510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:159px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">5425</td>
			<td style="width:255px;">Diluted to 30% in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MAPKYT (dpERK) antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M9692</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:400 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Secondary antibody</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11005</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:500 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:159px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">*M9 Buffer Recipe</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">**PBS (1X)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline

إشارة الخلية الحفظ تطويريا transducing RTK-RAS-إرك المسار هو سلسلة مما يشير كيناز الهامة التي تسيطر على العديد من العمليات الخلوية والتنموية أساسا عن طريق تنشيط إرك، كيناز النهائية للمسار. تنظيم محكم من النشاط إرك ضروري للتطور الطبيعي والتوازن. النتائج إرك نشطة بشكل مفرط في انتشار الخلوي المفرط، في حين الدرقية إرك يسبب موت الخلايا. C. ايليجانس هو نظام نموذجي القوية التي ساعدت توصيف وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير المسار خلال التنمية. على وجه الخصوص، وطريقة RTK-RAS-إرك ضروري لC. ايليجانس تطوير سلالة الجرثومية، التي هي محور هذا الأسلوب. عن طريق الاجسام المضادة المحددة لشكل نشط، diphosphorylated من إرك (dpERK)، ونمط التعريب النمطية يمكن تصور داخل الخط الجرثومي. لأن هذا النمط هو مكانيا وزمانيا وسيطرواالطبعه، والقدرة على مقايسة بتكاثر dpERK مفيد لتحديد المنظمين من المسار الذي يؤثر على dpERK مدة إشارة والسعة والتنمية وبالتالي سلالة الجرثومية. نحن هنا لشرح كيفية تشريح بنجاح، وصمة عار، وdpERK الصورة داخل C. ايليجانس الغدد التناسلية. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتوطين المكاني للأي إشارات أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، قدم الأجسام المضادة متوافق مع المناعي هو متاح.

في WT الكبار الحيوانات خنثوي، هو تصور dpERK عادة في منطقة منتصف طور التثخن، المنطقة 1، وفي البويضات الأكثر نضجا من -1 من خلال -4 أو -5 (المنطقة 2). الاضطرابات في هذا النمط تفعيل تعكس تغييرات على مسار الإشارات. germlines الإناث لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لا تعرض تفعيل إرك في المنطقة 2، مع تفعيل ضعيف في المنطقة 1. وتتمثل هذه في الشكل (5). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> الشكل 1: C. ايليجانس سلالة الجرثومية الصرف. التفاضلية التداخل المقابل (DIC) صورة لخنثى الكبار مع الذراع الغدد التناسلية على شكل حرف U واحد المذكورة مع خط أبيض. والغدد التناسلية خنثوي الكبار يحتوي على خلايا الإنقسامية في الطرف البعيد. الخلايا الإنقسامية تدخل الانقسام الاختزالي والتقدم من خلال الطور الأول الانتصافي (طور التثخن) النامية في maturالبويضات الإلكترونية في الغدد التناسلية الداني. المنطقة 1 والمنطقة 2 علامة توطين النمطي للdpERK في الغدد التناسلية خنثوي الكبار. الحجم: 20 ميكرون <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> الشكل 2: مظاهرة من المراكز إبرة أثناء تشريح اليسار: صورة لتشريح في العملية. الصحيح: مواقف إبرة مع الإشارة إلى دودة <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> الشكل (3): مظاهرة من إعداد الاغاروز الشرائح. (أ) وضع lengthwis الشريطالبريد عبر 2 شرائح المجهر نظيفة. ضع شريحة المجهر نظيفة جديدة بين الشرائح اثنين مع الشريط كما هو مبين. الشرائح الثلاث بجانب بعضها البعض طوليا. (ب) إضافة ذاب الاغاروز إلى الشريحة في الوسط. (C) ضع شريحة المجهر جديدة عمودي، وعلى رأسها، الشريحة المتوسطة، تحمل قطرة الاغاروز. ( D) السماح للالاغاروز ليصلب. (E) إزالة الشريحة العليا تاركة وراءها وحة agarose طدت. استخدام الشريحة السفلية مع لوحة الاغاروز لgermlines تصاعد تشريح والملون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> الشكل 4: التصوير الشرائح كما المونتاج المونتاج من نوع سلالة الجرثومية البرية مع دابي (ر.المرجع) وقناة dpERK (القاع). الصور التي اتخذت في 63X مع تداخل الحدود، اتخذت المربعات البيضاء لوحة ألف وباء وصناديق خضراء لوحة باء وجيم ودابي وdpERK الصور لكل لوحة في وقت واحد في اثنين من قنوات مختلفة. يتم عرض صورة تجميعها في الشكل 5A. مقياس شريط: 20 ميكرومتر <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> الرقم 5: الديناميكي الزمنية / المكانية تفعيل إرك. (AC) WT (N2) الكبار (24 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) germlines خنثى ملطخة الحمض النووي (B، دابي والأبيض) وdpERK (C، الحمراء). يتم تمييز إشارة dpERK في المنطقة 1 والمنطقة طور التثخن، والمنطقة 2، البويضات الناضجة. (DF)الضباب 2 (oz40) germlines الإناث (في 8 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) ملطخة الحمض النووي (E، دابي) وdpERK (F). germlines الإناث الصغيرات عرض dpERK ضعيفة في المنطقة 1، وفي بويضة واحدة بطريقة مستقلة الحيوانات المنوية. المنطقة 2 هي الحيوانات المنوية يتوقف، وبالتالي غائبة في سلالة الجرثومية الإناث. مقياس شريط: 20 ميكرومتر <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

نقدم طريقة القائم على التصوير المناعي للتوطين المكاني والزماني لإرك نشط في C. تشريح ايليجانس الغدد التناسلية. بروتوكول صفها هنا يمكن تكييفها لرؤية أي إشارة أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، شريطة الضد كاشف مناسب هو متاح.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

قناة Excretory C. ايليجانس كنموذج ل Morphogenesis التجويف داخل الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي في "خلية واحدة": وضع العلامات بالتجارة والنقل-الأنشطار والشاشة التفاعل [رني] والتصوير

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...