Name: spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.

<ol>
	<li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li><li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK/MAPK.">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+RTK-Ras-ERK+signaling+and+related+alternative+pathways.">Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways.</a> WormBook. , 1-38 (2013).</li><li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+apoptosis:+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer.">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li><li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis:+an+additional+case+report.">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li><li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+specificity:+the+right+place+at+the+right+time.">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li><li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pfeiffer+syndrome.">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).</li><li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells.">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li><li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling:+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li><li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling.">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li><li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li><li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis.">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li><li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation.">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li><li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation.">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li><li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade,+mek-2,+mpk-1/sur-1+and+let-60+ras,+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li><li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gonad:+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology.">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module.">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development.">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li><li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline.">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li><li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gld-1,+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans.">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li><li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster.">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li></ol>

The authors declared that no competing interests exist.

ERK Active (dpERK) כדלקמן דפוס לוקליזציה מרחבית ודינמי סטריאוטיפית של ג germline elegans. דפוס מרחבי שבלונות dpERK זה (איור 5), משרעת ב מבוגר ג בלוטת המין elegans, יכול להיות מתואמים באופן יעיל עם תהליכים ביולוגיים רבים ERK מסדיר. לדוגמה, חוסר יכולת להפעיל ERK ב Zone 2 תוצאות מעצר ביציות ב prophase של המיוזה, פנוטיפ שנצפתה germlines נקבה שלא צוין הזרע, ובכך לא תפעיל ERK ב ביציות בוגרות (איור 5). הזדווגות עם התוצאות של הזכרים בצבירת יעיל של dpERK אזור 2 germlines נקבת 11,13, בשילוב עם הופעת התבגרות ביוץ ביצית. לכן ניתוח של דפוסים מרחביים והפעלה זמנית של dpERK על הפרעות גנטיות מסוימות (כגון איון גן בתיווך התערבות RNA) או טיפולים כימיים מאפשר זיהוי של גורמי reguאיתות ERK מאוחר ולכן תהליכים ביולוגיים ERK תלויים. ניתוחים כאלה גם לאפשר גילוי אינטראקציות גנטיות רומן בין מסלולי איתות. צוואר בקבוק קריטי עבור כל ניתוח מבוסס הדמיה הוא הזמינות של חומרים כימיים פונקציונליים, כגון נוגדנים ספציפיים ליישום. אם ריאגנט כזה אז שיטות כגון זה המתואר לעיל ניתן להתאים בקלות לניתוח דפוס לוקליזציה עבור כל חלבון של עניין. היישום ובכך הוא מוגבל על ידי הזמינות של נוגדני תפקוד. בנוסף, כיוון שאמצעי מתאר דיסקציה מכתים בכל פעם התפתחותי נתון, זה רק מאפשר לכידה של מידע במסגרת אחת זמן, ואינו לשפוך אור על הדינמיקה או תקנה חלבון בזמן אמת או שיעור מחזור חלבון. השיטה המתוארת לעיל מותאמת אל פרנסיס et. 23, והוא שונה מן מ סידו ו דאןethod 24 לשחול בלוטת המין מכתים נוגדן. השיטה המבוססת על פרנסיס et al. תיקרא &quot;שיטת ההשעיה&quot; ושיטת סידיו ו דאן נקראה &quot;שיטת פיצוח להקפיא&quot; להשוואה. שיטת ההשעיה הייתה יעילה מאוד בידינו לקבלת דפוסי לוקליזציה לשחזור של מולקולות איתות כגון dpERK, כי מטבעם רגישים יותר לתנאי טיפול קשים. במקרה של לוקליזציה dpERK שעל פי ניסיוננו, אות אזור 1 היא כמעט בלתי ניתנת לגילוי באמצעות שיטת פיצוח ההקפאה. בנוסף, ייבוש מדגם, אשר לעתים קרובות יכול להתרחש עם שיטת פיצוח ההקפאה, תוצאות אותות נוגדן מזויפים. שיטת ההשעיה ממזערת ייבוש מדגם, מאז בלוטות המין מושעות בתוך נוזל לאורך כל התהליך. כמו כן, אנו מוצאים כי שיטת ההשעיה שימושית הדמית גנוטיפים שונים מרובים בשקופית אחת. לדוגמה, אם שני גנוטיפים, כגון הרמפרודיטים vsהנקבות כדי להשוות ישירות ללוקליזציה dpERK, שני גנוטיפים ניתן לערבב יחד ומעובד. זה אפשרי מכיוון פנוטיפים הם ברורים ניתן להבחין באמצעות מורפולוגיה DAPI. מכתים באותו צינור ואחריו הדמיה באותו שקופיות מאפשר השוואה ישירה בין בלוטות המין מן גנוטיפים שונים. לחלופין, אם מורפולוגיה DAPI אינן שונות, אז מכתים נוגדן שני שלבים יכולים להיות מאומץ. ראשית כל גנוטיפ פרט מטופל עם שני נוגדנים שונים, נוגדן A עבור WT ו נוגדן B עבור מוטציה (שני הנוגדנים שיועלו לארח נבדלת נוגדן dpERK). לאחר שני גנוטיפים כבר מוכתם עם הנוגדן הראשוני, ורחצו, הם יכולים להיות מעורבים יחד צינור אחד ועכשיו מוכתם נוגדן dpERK, ואחריו טיפול נוגדנים משני לדמיין את כל הנוגדנים בצינור. יכולת להשוות גנוטיפים שונים בשקופית אחת, במיוחד כאשר דeductions של דפוסי הפעלה נעשה מבטיח פרשנויות מדויקות לא שנפגעו ממחלות או מכתים ברורה. בעוד יתרון, ישנם צעדים רבים ברחבי שיטת ההשעיה הדורשים מניפולציה זהירה. זה קריטי, כי והניתוחים להתרחש בתוך זמן בצורה יעילה; חשוב, והניתוחים לא צריכים לקחת יותר מ -5 דקות. פעמים לנתיחה עוד ליצירת אות dpERK משתנית, אשר לעתים קרובות יכול להיות שלא כהלכה כשינויים מוסדרים הפעלת ERK, ולא תקלות טכניות כמו. זה חיוני כדי להתחיל עם למעלה מ 100 - 150 חיות עבור כל לנתיחה משום שבמהלך לשטוף השונה צעדי בלוטות המין יכול ללכת לאיבוד בקלות מן הצינורות בגלל שגיאות pipetting. הפסד של בלוטות המין, ניתן להפחית באמצעות לנתח בקבוצות קטנות מרובות (כגון שלוש קבוצות של 50 חיות כל) כי ניתן לשלב, או על ידי לנתח אצווה אחת גדולה של 150. אתגר נוסף הוא מקבל את בלוטות המין לשכב באר כמרווח היווצרותניתן הדמיה בשקופית כך בלוטת המין דיסטלי כולו. כדי לאפשר זאת, השתמש עפעף על גפרור או טפטפת משך לחלל את בלוטות המין. עם זאת, יש להיזהר כדי לא לפגוע בלוטות המין במהלך תהליך זה. לעתים קרובות עם טכניקות אלה שנדרש ניסיונות מרובים להשתלט על והניתוחים וכן הסדרים של בלוטות המין על השקופיות. לאחר הטכניקה הזו כבר שולטת, היא משמשת שיטה חזקה ניתוחים ביולוגיים מגוונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד יותר מסתם רמות dpERK. לדוגמה שיטה זו יכולה לשמש כדי לחזות רמות p38 פעילות, או רמות CDK פעילות, או כל חלבון עבורו מגיב נוגדן קיים. בנוסף, השיטה יכולה להיות בשילוב עם מסך עיכוב כימי בחיות כולו assay למעכבי רומן או activators של המסלול, באמצעות assaying עבור רמות dpERK. זה יאפשר שהוקרא ממחשב in vivo של שניהם התגובה ורגישה לכל מעכבים שעשויים interact עם מסלול איתות RTK-RAS-ERK. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בצירופי נוגדן עם יציאות איתות רבות שיכולים לשמש כל ו מדמיינים בבת אחת. באמצעות מספר נוגדנים מאפשר קורלציה בין מסלולים, מצב ההפעלה שלהם, ותוצאות כל זאת במסגרת של אותה הרקמה, המאפשר הבנה טובה יותר של האינטראקציות הללו. אלה הם רק כמה דוגמאות של יישומים נוספים של שיטה זו, אך מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד תחומי מחקר מרובים.

טירוזין קינאז קולטן (RTK) סרקומה -RAt (RAS) אות -Extracellular מוסדרים קינאז (ERK) מסלול ומשדר אותות תאיים דרך מפל קינאז משומר שתוצאתו זירחון והפעלה של ERK 1-3. חלבונים ERK הם חברי MAP סרין / תראונין פרולין מכוונת משומר (חלבון הופעל mitogen) המשפחה קינאז, ושמופעלים ישירות על ידי MEK באמצעות זירחון כפול על תראונין (T) ו טירוזין (Y) של מוטיב טיי משומר. ERK Active (המכונה diphosphorylated ERK, או dpERK) אז מסדיר תהליכים תאיים והתפתחותיות רבים באמצעות זירחון של סוללה של מצעים במורד 1-3. לפיכך פעילות ERK חריגה מובילה סלולארי רבים ופגמים התפתחותיים 4-7. רגולצית מחמירות פעילות ERK היא קריטית להתפתחות נורמלית: במערכות יונקות יותר מדי פעילות ERK מובילה מוביל תרבות תאים מופרזתלצמיחה בשעור; מעט מדי פעילות מוביל מוות של תאים 4,6. בנוסף, שינויי משך פעילות ERK גם יכולים להוביל לתוצאות ברורות: בתאי PC12, הפעלת ERK למשך 30 דקות או פחות פרוליפרציה תא, אך הפעלת ERK למשך 60 דקות או יותר גורם בידול עצבי 8,9. רגולציה הדוקה של פעילות ERK כן חיונית בבירור לפיתוח הומאוסטזיס נורמלי. סי אלגנס הוא מערכת מודל עצמה, וגנטי נזילה לנתח את הפונקציה ורגולציה של ומסלול RTK-RAS-ERK איתות 3,10-15. יחסית למערכות יונקות, אשר מכילות מספר רב של גנים עבור ראס ERK, ג elegans מכיל גן אחד RAS (לתת-60) ואת גן ERK אחד (MPK - 1), מה שהופך אותו מערכת קלילה גנטי יותר שבו לנתח את הפונקציה של מסלול זה 3,10-14. ג germline elegans הוא למעשה צינור שמורכב mitoticתאי גזע בסופת דיסטלי ו ביציות בוגרות בקצה הפרוקסימלי שלו (איור 1) 16. תאי נבט ליזום המיוזה רק הפרוקסימלי לאזור mitotic דיסטלי, והתקדמות דרך prophase meiotic המורחבת (pachytene), לאחר מכן הם מתחילים להיווצר ביציות באזור לולאה, ולבסוף עוברת הבשלת הביצית באזור הפרוקסימלי 16. מחקרים גנטיים ממעבדות מרובות, כולל משלנו, הראו כי ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני להתפתחות germline ב C. elegans 12,13,15,17-19. באופן ספציפי, מצאנו כי בקרות ERK ומתאם לפחות תשעה תהליכים ביולוגיים ברורים במהלך ההתפתחות germline, החל מתגים התפתחותיים כגון אפופטוזיס תאי נבט לתא תהליכים ביולוגיים כגון 11,18 צמיחה הביצית. בדומה במערכות יונקות, יותר מדי פעילות ERK ב ג elegans תוצאות germline בייצור ביציות קטנות מרובות, בעוד מדי liתוצאות פעילות ttle ב ביצית אחד גדולה 11. לפיכך רגולציה הדוקה של dpERK חיונית להתפתחות germline נורמלית. הצורה הפעילה של ERK, דמיין כפי נוגדן ספציפי dpERK, מציגה דפוס לוקליזציה סטריאוטיפי, דינמי, bimodal: dpERK הוא גבוה במהלך אמצע pachytene (1 אזור, איור 1), נמוך באזור הלולאה וגבוה שוב בוגר ביציות (2 Zone, איור 1). לאחרונה, מצאנו כי תזונה פועלת באמצעות פקטור הגדילה דמוי האינסולין לרצפטור 1 (DAF-2) כדי להפעיל ERK אזור 1 12; עבודות קודמות הראו כי האות הזרע (באמצעות טירוזין קינאז קולטן Ephrin) מפעיל ERK אזור 2 13. בהתחשב בכך פונקציות ERK כהיותו רֵיאוֹסטָט ב germline להסדיר צמיחת ביצית, לוקליזציה במרחב ובזמן, כמו גם משרעת של dpERK, הוא מפתח להבנת תוצאת האיתות הרגילה שלו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, שינוייםלוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK ניתן לנטר בקלות תחזיות נגזרו על ההשפעה של ההפרעות הסביבתיות או גנטיות על פעילות ERK ובכך פונקציה. לכן, מנסה לאמוד עבור dpERK מאפשר הבנה מקיפה של התפקיד שלו בעת פיתוח germline.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:255px;">Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Flat bottom glass watch dish</td>
			<td style="width:159px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGL4161</td>
			<td style="width:255px;">We use glass, because dissected gonads often stick to plastic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">25 gauge needles</td>
			<td style="width:159px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes (could be 1 or 5 ml)</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringes</td>
			<td style="width:119px;">1 ml: BD 309659</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-343</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coverslips (24x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">2935-245</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">5ml glass conical tube</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8060-5</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9&#34; disposable Pasteur pipette</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Clinical bench top centrifuge</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glass&#160; tubes (6x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">14-958-A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">*M9 solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">3% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td style="width:119px;">17500</td>
			<td style="width:255px;">Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">**PBS</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1X PBST</td>
			<td style="width:159px;">1X PBS with 0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td>18510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:159px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">5425</td>
			<td style="width:255px;">Diluted to 30% in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MAPKYT (dpERK) antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M9692</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:400 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Secondary antibody</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11005</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:500 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:159px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">*M9 Buffer Recipe</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">**PBS (1X)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline

האות התאי השמור באבולוציה transducing ומסלול RTK-RAS-ERK הוא קינאז-איתות חשוב מפל השולט תהליכים תאיים ו התפתחותיים מרובים בעיקר באמצעות הפעלה של ERK, קינאז המסוף של המסלול. רגולציה הדוקה של פעילות ERK חיונית להתפתחות נורמלית הומאוסטזיס; תוצאות פעילות ERK יתר על מידת תרבות תאים מופרזת, תוך תת ERK גורמת מוות של תאים. ג elegans היא מערכת מודל רב עוצמה סייעה לאפיין את הפונקציה ורגולציה של מסלול איתות RTK-RAS-ERK במהלך הפיתוח. בפרט, ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני ג elegans פיתוח germline, המהווה את המוקד של שיטה זו. באמצעות נוגדנים ספציפיים הצורה הפעילה, diphosphorylated של ERK (dpERK), דפוס הלוקליזציה הסטריאוטיפי ניתן דמיין בתוך germline. בגלל דפוס זה הוא במרחב ובזמן בשליטהed, היכולת assay dpERK reproducibly שימושית כדי לזהות הרגולטורים של מסלול המשפיעים משך אות dpERK משרעת ובכך פיתוח germline. כאן אנו מדגימים כיצד לנתח בהצלחה, כתם, ותמונה dpERK בתוך ג בלוטת מין elegans. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור לוקליזציה המרחבי של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, ובלבד נוגדן תואם immunofluorescence זמין.

אצל בעלי חיים hermaphroditic מבוגר WT, dpERK הוא מדמיין בדרך כלל באזור אמצע pachytene, 1 אזור, ובסופו של ביציות בוגרות ביותר מ -1 דרך -4 או -5 (אזור 2). הפרעות בדפוס הפעלה זה לשקף שינויים מסלול איתות. Germlines נקבה לא תציין זרע, ובכך אינו מוצגת הפעלה של ERK ב Zone 2, עם הפעלת התורפה היחידה Zone 1. אלו מיוצגות באיור 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> איור 1: ג elegans germline מורפולוגיה. התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) תמונה של אנדרוגינוס מבוגר עם אחד בצורת U בלוטת מין זרוע התווה עם הקו הלבן. בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic מכיל תאים mitotic בקצה הדיסטלי. התאים mitotic להיכנס המיוזה והתקדמות דרך prophase meiotic (pachytene) מלהתפתח מטורביציות דואר ב בלוטת המין הפרוקסימלי. אזור 1 ו Zone 2 סימן לוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK בתוך בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic. סולם:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> איור 2: הפגנה של פוזיציות מחט במהלך וניתוחי שמאל:. תצלום של דיסקציה בתהליך. מימין:. מחט עמדות תוך התייחסות התולעת <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> איור 3: הפגנה של שקופיות Agarose כנות. (א) מניחים קלטת lengthwisדואר ברחבי 2 שקופיות מיקרוסקופ נקיות. מקום שקופית מיקרוסקופ נקי טרי בין שתי השקופיות עם הקלטת כמוצג. השלוש השקופיות הן אחד ליד לאורכו אחר. (ב) הוספה נמס agarose לשקופית במרכז. (C) מקום שקופית מיקרוסקופ טרי בניצב, ועל גבי, השקופית באמצע, נושא את טיפת agarose. ( D) אפשר agarose כדי לחזק. (E) להסיר את השקופית העליונה והותיר אחריו כרית agarose הקרושה. השתמש שקופיות התחתונות עם כרית agarose להרכבת גזור ומוכתמת germlines. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> איור 4: הדמיה השקופית כמו Montage Montage של germline סוג בר עם DAPI (t.op) ו dpERK (ערוץ תחתון). תמונות שצולמו ב 63X עם גבולות חופפים, תיבות לבנות עבור פנל ו- B ותיבות ירוקות עבור לוח ב &#39;ו-ג DAPI ו dpERK תמונות עבור כל לוח נלקחו בו זמנית בשני ערוצים שונים. התמונה התאספה מוצגת איור 5 א. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> איור 5: Dynamic Temporal / מרחבית הפעלת ERK. (AC) WT (N2) מבוגר (24 השעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) אנדרוגינוס germlines מוכתם עבור DNA (B, DAPI, לבן) dpERK (C, אדום). אות dpERK אזור 1, באזור pachytene, ואת האזור 2, הביציות הבשלות מודגשת. (DF)ערפל-2 (oz40) germlines נקבה (ב 8 שעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) מוכתם עבור DNA (E, DAPI) ו dpERK (F). germlines נקבה צעירה להציג dpERK החלש אזור 1, וב ביצית יחידה באופן זרע עצמאי. אזור 2 הוא זרע תלוי, ובכך נעדר germline הנשי. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...