Name: spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.

<ol>
	<li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li><li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK/MAPK.">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+RTK-Ras-ERK+signaling+and+related+alternative+pathways.">Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways.</a> WormBook. , 1-38 (2013).</li><li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+apoptosis:+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer.">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li><li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis:+an+additional+case+report.">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li><li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+specificity:+the+right+place+at+the+right+time.">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li><li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pfeiffer+syndrome.">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).</li><li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells.">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li><li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling:+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li><li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling.">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li><li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li><li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis.">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li><li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation.">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li><li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation.">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li><li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade,+mek-2,+mpk-1/sur-1+and+let-60+ras,+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li><li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gonad:+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology.">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module.">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li><li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development.">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li><li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline.">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li><li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gld-1,+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans.">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li><li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster.">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li></ol>

The authors declared that no competing interests exist.

Активный ЭРК (dpERK) следует стереотипную пространственную и динамическую картину локализации в C. Элеганс зародышевой. Это стереотипное dpERK пространственная структура (рисунок 5), а амплитуда у взрослого C. Элеганс гонад, может быть эффективно коррелируют со многими биологическими процессами , которые регулируют ЭРК. Например, неспособность активировать ERK в Зоне 2 приводит арест в ооциты в профазе мейоза, фенотип наблюдается у самок germlines , которые не указывают спермы, и , таким образом , не активируют ERK в зрелых ооцитов (рисунок 5). Спаривание с результатами самцов в процессе эффективного накопления dpERK в Зоне 2 в женских germlines 11,13, в сочетании с началом созревания ооцитов и овуляции. Таким образом, анализ пространственных структур и временной активации dpERK при определенных генетических возмущений (таких как РНК-интерференции, опосредованной инактивации генов) или химической обработки позволяет идентифицировать факторы, которые Reguв конце передачи сигналов ERK и, таким образом, ERK-зависимые биологические процессы. Такие анализы позволяют также открытие новых генетических взаимодействий между сигнальными путями. Критическим узким местом для любого на основе анализа изображений является наличие функциональных реагентов, таких как антитела, которые являются специфическими для приложения. Если такой реагент существует, то методы, такие, как описанный выше, может быть легко адаптирована для анализа локализации шаблона для любого белка, представляющего интерес. Приложение, таким образом, ограничивается наличием функционирующего антитела. Кроме того, так как метод описывает рассечение и окрашивания в определенный момент времени развития, он позволяет только захват информации в один период времени, и не пролить свет на динамику или регуляции белка в режиме реального времени или скорости оборота белка. Описанный выше метод заимствован из Francis и др. 23, которая отличается от Сейду и Dunn меню 24 для гонад экструзии и с использованием меченых антител. Метод , основанный на Francis и др. Будет называться &quot;метод подвески&quot; и метод Сейду и Dunn называется «замораживать растрескиванию метод&quot; для сравнения. Метод подвески была очень эффективна в наших руках для получения воспроизводимых моделей локализации сигнальных молекул, таких как dpERK, которые по своей природе более чувствительны к суровым условиям обработки. В случае локализации dpERK, в нашем опыте, сигнал в зоне 1 практически невозможно обнаружить с помощью метода сублимационной растрескиванию. Кроме того, образец для сушки, которые часто могут возникать с методом сублимационной растрескиванию, приводит к паразитных сигналов антител. Способ подвески сводит к минимуму образец сушки, так как гонады подвешены в жидкости в течение всего процесса. Мы также считаем, что метод подвески полезно для получения изображений нескольких различных генотипов на одном слайде. Например, если два генотипы, такие как гермафродитов противСамки должны быть непосредственно по сравнению локализации dpERK, два генотипы могут быть смешаны вместе и обработаны. Это возможно потому , что фенотипы различны и могут быть выделены с помощью DAPI морфологией. Окрашивание в той же трубе с последующей обработки изображений на одном предметном стекле позволяет для прямого сравнения между половыми железами разных генотипов. В качестве альтернативы, если DAPI морфологию не различимы, а затем с использованием меченых антител двухступенчатый может быть принят. Во-первых каждый отдельный генотип обрабатывают двумя различными антителами, Антитело А при WT и антителу B для мутанта (оба антитела должны быть подняты в хозяине, отличной от антитела dpERK). После того, как два генотипы были окрашены с первичным антителом, и промывают, они могут быть смешаны друг с другом в одной трубке, и теперь окрашивали антителом dpERK, с последующей обработкой вторичным антителом для визуализации всех антител в трубке. Возможность сравнения различных генотипов на одном слайде, особенно когда deductions паттернов активации делаются обеспечивает высокую точность интерпретации не затронутых различных условий окрашивания. В то время как выгодно, есть несколько шагов, на протяжении метода подвески, которые требуют тщательного манипуляций. Очень важно, что диссекция происходит в то время, эффективным образом; важно то, что диссекция не следует принимать в течение 5 мин. Более длительное время рассечение в результате переменного сигнала dpERK, которые часто могут быть неверно истолкованы как регулируемые изменения в активации ERK, а не в качестве технических сбоев. Крайне важно, чтобы начать с более чем 100 - 150 животных для каждого рассечение, потому что на протяжении различных мытья шаги гонады могут быть легко потеряны из труб из-за ошибок при использовании пипеток. Потеря гонад может быть уменьшена либо путем рассечения в нескольких небольших партий (например, три порции по 50 животных в каждой), которые могут быть объединены, или рассечением одну крупную партию 150. Еще одной проблемой становится все гонады лежать в хорошо разнесены формированиена слайде таким образом, что весь дистальный гонад может быть отображена. Для включения этого использовать ресничку на спичкой или запряженных пипеткой в ​​космос из гонад. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить гонады во время этого процесса. Часто с этими методами она занимает несколько попыток овладеть вскрытий, а также аранжировки гонад на слайдах. После того, как эта техника была освоена, она служит мощным методом для различных биологических анализов, и может быть использовано для изучения более чем просто уровней dpERK. Например, этот метод может быть использован для визуализации активных уровней р38 или активных уровней CDK или любой белок, для которых реагент антитела существует. Кроме того, способ может быть соединен с экраном химическое ингибирование в целых животных для анализа на новых ингибиторов или активаторов пути, с помощью анализа на уровне dpERK. Это позволит для считывания в естественных условиях обоих реакции и чувствительности к любым ингибиторам , которые могут ИНТeract с сигнального пути РТК-RAS-ERK. Более того, этот метод может быть использован в комбинации с антителом несколькими выходами сигнализации, которые могут быть использованы и визуализированных в одно время. Использование нескольких антител позволяет корреляцию между несколькими путями, их статус активации, и результаты все в пределах той же ткани, что позволяет более глубокое понимание этих взаимодействий. Это всего лишь несколько примеров дальнейшего применения этого метода, но эта система может быть изменена для изучения нескольких научных интересов.

Рецепторных тирозинкиназ (РТК) -RAt саркомы (РАН) -Extracellular сигнал регулируемой киназы (ERK) путь реле внеклеточные сигналы через консервативному киназы каскада , что приводит к фосфорилированию и активации ERK 1-3. ERK белки являются членами законсервированного пролина направленной серин / треонин MAP (митоген активированный протеин) киназ, и непосредственно активируются МЕК с помощью двойного фосфорилирования на треонин (Т) и тирозина (Y) сохраняющегося TEY мотива. Активный ЭРК (называемый diphosphorylated ERK или dpERK) , а затем регулирует многие клеточные и процессы , сопровождающие развитие через фосфорилирование батареи ниже по течению субстратов 1-3. Таким образом , ненормальное ERK активность приводит к большому количеству клеток и дефектов развития 4-7. Строгое регулирование ЭРК деятельности имеет решающее значение для нормального развития: в системах млекопитающих слишком много ERK активность приводит к избыточному ведущих клеточной пролиферациидля онкогенного роста; слишком мало активности приводит к гибели клеток 4,6. Кроме того, изменения в продолжительности ЭРК активности также может привести к различным результатам: в клетках PC12, активацию ERK в течение 30 мин или меньше индуцирует пролиферацию клеток, но активацию ERK в течение 60 мин или более индуцирует дифференцировку нейронов 8,9. Tight регуляция активности ERK, таким образом, очевидно, необходимы для нормального развития и гомеостаза. C. Элеганс является мощным, и генетически податливым модель системы рассекать функции и регулирование РТК-RAS-ERK сигнального пути 3,10-15. По отношению к системам млекопитающих, которые содержат несколько генов РАН и ERK, C. Элеганс содержит один ген RAS (пусть-60) и один ген ERK (MPK - 1), что делает его генетически более легкое систему , в которой рассекать функцию этого пути 3,10-14. C. Элеганс зародышевой по существу трубка , которая состоит из митотическихстволовые клетки на своем дистальном конце и зрелых ооцитах на своем ближнем конце (рис 1) 16. Половые клетки инициируют мейоз только проксимального к дистальному зоне митоза, и прогресс с помощью расширенного мейоза профазе (пахитены), после чего они начинают формироваться ооциты в области петли, наконец , проходит созревание ооцитов в проксимальной области 16. Генетические исследования из нескольких лабораторий, в том числе наши собственные, показали , что путь РТК-RAS-ERK имеет важное значение для развития зародышевой в C. Элеганс 12,13,15,17-19. В частности, мы обнаружили , что элементы управления ERK и координирует , по меньшей мере девять различных биологических процессов во время развития зародышевой, начиная от коммутаторов развития , таких как апоптоз зародышевой клетки к клетке биологические процессы , такие как 11,18 роста ооцитов. Так же, как в системах млекопитающих, слишком много ЭРК активности в C. Элеганс результаты зародышевых в производстве нескольких небольших ооцитов, тогда как слишком LiРезультаты ttle активности в одном большом ооцит 11. Таким образом плотно регулирование dpERK имеет важное значение для нормального развития зародышевой. Активная форма ЭРК, как и визуализировали антителом , специфичным к dpERK, отображает стереотипное, динамичный, бимодальный образец локализации: dpERK высока в течение середины пахитене (зона 1, рисунок 1), низко в области петли и высокий снова в зрелые ооциты (зона 2, рисунок 1). В последнее время , мы обнаружили , что питание действует через инсулин-подобный фактор роста рецептора-1 (ДАФ-2) , чтобы активировать ERK в зоне 1 , 12; Предшествующая работа показала , что сигнал спермы (через рецептор тирозинкиназы эфрин) активирует ERK в Зоне 2 13. Учитывая, что активные ERK функционирует как реостат в зародышевой для регулирования роста ооцитов, пространственной и временной локализации, а также амплитуду dpERK, является ключом к пониманию его нормального результата сигнализации. Используя метод, описанный здесь, изменения встереотипное локализация dpERK можно легко контролировать и прогнозы, полученные на воздействие окружающей среды или генетических возмущений на ЭРК активности и, следовательно, функции. Таким образом, для опробования dpERK дает полное представление о его роли в процессе зародышевого развития.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:255px;">Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Flat bottom glass watch dish</td>
			<td style="width:159px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGL4161</td>
			<td style="width:255px;">We use glass, because dissected gonads often stick to plastic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">25 gauge needles</td>
			<td style="width:159px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes (could be 1 or 5 ml)</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringes</td>
			<td style="width:119px;">1 ml: BD 309659</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-343</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coverslips (24x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">2935-245</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">5ml glass conical tube</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8060-5</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9&#34; disposable Pasteur pipette</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Clinical bench top centrifuge</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glass&#160; tubes (6x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">14-958-A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">*M9 solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">3% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td style="width:119px;">17500</td>
			<td style="width:255px;">Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">**PBS</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1X PBST</td>
			<td style="width:159px;">1X PBS with 0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td>18510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:159px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">5425</td>
			<td style="width:255px;">Diluted to 30% in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MAPKYT (dpERK) antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M9692</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:400 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Secondary antibody</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11005</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:500 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:159px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">*M9 Buffer Recipe</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">**PBS (1X)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline

Эволюционно консервативными внеклеточный сигнал трансдукции РТК-RAS-ERK путь является важной киназа-сигнальный каскад , который контролирует множество клеточных и развития процессов , главным образом посредством активации ERK, терминальной киназы пути. Tight регулирование ЭРК деятельности имеет важное значение для нормального развития и гомеостаза; чрезмерно активные ERK приводит к чрезмерной пролиферации клеток, в то время как пониженная ЭРК вызывает гибель клеток. C. Элеганс является мощной моделью системы , которая помогла охарактеризовать функции и регулирование РТК-RAS-ERK сигнального пути в процессе разработки. В частности, путь РТК-RAS-ERK , имеет важное значение для C. Элеганс развитие зародышевой линии, которая находится в центре внимания этого метода. С помощью антител , специфичных к активному, diphosphorylated форме ЭРК (dpERK), стереотипные модели локализации могут быть визуализированы в зародышевой. Поскольку эта модель является одновременно во времени и пространстве Controllе изд, способность к воспроизводимым пробирного dpERK полезен для идентификации регуляторов пути, которые влияют на длительность сигнала dpERK и амплитуду и, таким образом, зародышевую развитие. Здесь показано , как успешно рассекать, пятно и dpERK изображения в C. Элеганс гонад. Этот метод может быть адаптирован для пространственной локализации любой сигнализации или структурного белка в C. Элеганс гонад, при условии , антитело совместим с иммунофлуоресценции доступен.

В WT взрослых гермафродитных животных, dpERK обычно визуализируется в середине пахитены области, зоны 1, а в наиболее зрелых ооцитов от -1 до -4 или -5 (зона 2). Возмущения в этой модели активации отражают изменения сигнального пути. Женский germlines не уточняют спермы, и , таким образом , не проявляют активацию ERK в зоне 2, только слабой активации в зоне 1. Они представлены на рисунке 5. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> Рисунок 1: C. Элеганс зародышевой Морфология. Дифференциальная интерференционного контраста (ДИК) изображение взрослого гермафродита с одной U-образной гонад руки обведены белой линией. Взрослый гермафродитами гонад содержит митотических клеток на дистальном кончике. Митотические клетки вступают в мейоз и прогресс через мейоза профазе (пахитены) развивается в Матуре ооциты в проксимальном гонад. Зона 1 и Зона 2 знака стереотипное локализации dpERK во взрослом гермафродитической гонады. Масштаб:. 20 мкм <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> Рисунок 2: Демонстрация игольчатые позиций во время вскрытий . Слева: Фотография рассечения в процессе. Справа:. Игольчатые позиции со ссылкой на червя <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">чтобы увидеть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> Рисунок 3: Демонстрация слайдов Агарозном Подготовка. (A) Поместите ленту lengthwisе через 2 чистые предметные стекла микроскопа. Поместите свежий чистый стекло микроскопа между двумя предметными стеклами с лентой, как показано на рисунке. Три горки рядом друг с другом в продольном направлении . (В) Add расплавленную агарозу к слайду в центре. (C) Поместите свежий стекло микроскопа перпендикулярно, и на вершине, средний слайд, несущий каплю агарозы. ( D) Разрешить агарозы , чтобы затвердеть. (Е) Снимите верхний слайд , оставляя за затвердевшего агарозном площадку. Используйте нижний слайд с агарозном площадку для монтажа расчлененных и окрашивали germlines. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> Рисунок 4: Визуализация слайдах как Montage Montage дикого типа зародышевой с DAPI (т.ор) и канал dpERK (внизу). Изображения, полученные при 63x с перекрытием границы, были взяты белые коробки для панели А и В и зеленые коробки для панели B и C. DAPI и dpERK изображений для каждой панели одновременно в двух разных каналах. Собранное изображение показано на рисунке 5А. Шкала бар:. 20 мкм <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> Рисунок 5: Динамическая временная / пространственная активация ERK. (AC) WT (N2) для взрослых (24 часа мимо середины L4 стадии развития) гермафродитные germlines окрашивали ДНК (B, DAPI, белый) и dpERK (C, красный). Сигнал dpERK в зоне 1, область пахитены и Zone 2, зрелых ооцитов подсвечивается. (DF)Туман-2 (oz40) женские germlines (через 8 ч мимо середины L4 стадии развития) окрашиваются по ДНК (Е, DAPI) и dpERK (F). Молодые женщины-germlines дисплей слабый dpERK в зоне 1, и в одном ооцита в спермы независимым образом. Зона 2 зависит спермы, и, таким образом, отсутствует в женском зародышевой. Шкала бар:. 20 мкм <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline at JoVE.com

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Мы представляем метод обработки изображений на основе иммунофлюоресценции для пространственной и временной локализации активного ERK в рассеченной C. Элеганс гонад. Протокол , описанный здесь , может быть адаптирована для визуализации любой сигнализации или структурного белка в C. Элеганс гонад, при условии , подходящим реагентом антитело доступно.

Пространственный и временной анализ активного ERK в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Половые

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Анализ клеточного цикла в C. elegans микрофлорой с EdU аналог тимидина

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...