Name: act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Dyreforsøg skal overholde alle relevante statslige og institutionelle regler. 1. Fremstilling af reagenser <ol><li> For hydrogel monomeropløsning (A4P0): Tilføj 20 g acrylamid til 450 ml 0,1x phosphatpufret saltvand (PBS) og justere lydstyrken til 500 ml med 0,1 x PBS. ADVARSEL: acrylamidmonomerer er giftige. Udfør alle procedurer i et stinkskab med personlige værnemidler, herunder en ansigtsmaske, et laboratorium frakke, handsker og lukket tå sko. <ol><li> Umiddelbart før anvendelse, tilsættes 100 mg 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propan] dihydrochlorid til 40 ml hydrogel monomeropløsning (A4P0) i en 50 ml konisk rør under en emhætte . </li></ol></li><li> For den elektroforetiske væv clearing (ETC) buffer: Tilsæt 40 g natriumdodecylsulfat (SDS) og 12,37 g borsyre til 800 ml deioniseret H2O (dH 2 O). PH justeres til 8,5 med NaOH og justere lydstyrken til1 l med ekstra dH 2 O. ADVARSEL: SDS er en skadelig kemisk; derfor håndtere det med omhu. </li><li> På CUBIC-mount-opløsning: 250 g af sucrose, 125 g urinstof, og 125 g N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin til 150 ml dH2O og bringe volumenet til 500 ml med dH 2 O. </li></ol> 2. Prøveforberedelse &amp; Fiksering <ol><li> Aflivning af musen. <ol><li> Forbered alfaxalon (1 mg / kg) og xylazin (0,5 mg / kg) i den samme sprøjte. </li><li> Intraperitonealt injicere blandingen af ​​alfaxalon og xylazin og tillade 3 min for musen til at blive bevidstløs. </li><li> Vent til bedøvede mus ikke længere reagerer på smertefulde stimuli, såsom en hale knivspids, før du fortsætter. ADVARSEL: Følg hensigtsmæssige institutionelle retningslinjer for håndtering dyr. </li></ol></li><li> Transkardialt perfundere musen med 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) opløsningindeholdende heparin (100 U / ml) for at exsanguinate, efterfulgt af 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS (pH 7,4) 14. ADVARSEL: PFA løsning er giftigt. Udarbejdelsen af ​​PFA løsning og alle efterfølgende håndtering skal foregå i et stinkskab og med personlige værnemidler. </li><li> Skær musen hovedet, åbne huden, og bryde kraniet mellem øjnene ved hjælp af en lille saks. </li><li> Fjern stykker af kraniet ved hjælp af små, buede pincet. </li><li> Tag hjernen eller ønskede organer. </li><li> Inkuber hjernen og organer i post-fix 4% PFA opløsning ved 4 ° C natten over. BEMÆRK: For specifikke-region væv clearing, dissekere bestemt region eller trimme vævet efter væv fiksering. ADVARSEL: PFA løsning er giftigt. Den transcardial perfusion og alle efterfølgende mus håndtering skal foregå i et stinkskab og med personlige værnemidler. </li></ol> 3. Hydrogel Monomer Infusion og Polymerization <ol><li> Inkuber de faste organer i A4P0 hydrogel monomer opløsning ved 4 ° C i 12-24 timer med forsigtig omrystning. </li><li> Hydrogel monomer-infused væv polymerisation. <ol><li> Overfør prøven til et 10 ml rundbundet rør med 5 ml hydrogel monomeropløsning. Wrap toppen af ​​rundbundet rør med Parafilm. </li><li> Fjern oxygen fra rundbundet rør indeholdende hydrogelen-infused hele musehjerne prøve ved at boble nitrogen gennem væsken i 1 min. Hurtigt og stramt lukke prøven indeholdende rør. </li></ol></li><li> Overfør røret til et vandbad (37 ° C) i 2 timer. </li><li> Vask den polymeriserede prøve kortvarigt med 0,1 x PBS for at fjerne overskydende hydrogel. ADVARSEL: Hydrogel monomerer er giftige. For at undgå hudkontakt med hydrogel monomer, udføre alle procedurer i et stinkskab og med personlige værnemidler, herunder en ansigtsmaske, et laboratorium frakke, og handsker. BEMÆRK: polymeriseret vævkan lagres i 0,1 x PBS indeholdende natriumazid i mere end 2 uger ved 4 ° C. ADVARSEL: Natriumazid er meget og akut giftigt. Udfør alle procedurer i et stinkskab og med personlige værnemidler, herunder en ansigtsmaske, et laboratorium frakke, og handsker. </li></ol> 4. Elektroforetisk Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Overfør den polymeriserede prøve til et væv beholder og placere vævet beholder i ETC kammeret. </li><li> Fyld ETC kammer med ETC buffer hjælp peristatic pumpe. </li><li> Indstil ETC betingelser og køre ETC. Brug følgende indstillinger. <ol><li> For ETC indstillinger for hele organer, bruge følgende indstillinger: (1,5 amp), temperatur (37 ° C), køretid (6,0 h), pumpehastighed (30 rpm). </li><li> For ETC indstillinger for 1- til 2-mm tykke mus hjernen skiver Brug følgende indstillinger: strøm (1,5 amp), temperatur (37 ° C), køretid (2,0 h), pumpehastighed (30 rpm). </li></ol></li><li> Transfer than blokerede prøven til et 50 ml konisk rør med 45 ml 0,1 x PBS. de ryddede prøve vaskes flere gange med 0,1 x PBS, indtil der ikke bobler ses, når røret er kortvarigt rystet (for at bekræfte fuldstændig fjernelse af SDS). </li></ol> 5. immunmærkning af ACT-Behandlede væv <ol><li> For muse hele hjernen: Prøven inkuberes i en 3-ml mængde antistof opløsning indeholdende 1 x PBS, 6% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100 og 0,01% natriumazid (antistoffortyndingen opløsning) med en fortynding faktor på 1/500 for tyrosinhydroxylase (TH) antistof i 4 dage ved 37 ° C med mild omrystning. Erstat antistofopløsningen ved udgangen af ​​dag 2. <ol><li> Vask prøven i en 50 ml konisk rør med 45 ml 0,1 x PBS i 3 - 5 timer og ændre puffer hver time. </li><li> Prøven inkuberes i en 3-ml mængde antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for æsel-anti-kanin 488 sekundært antistof i 4 dage ved 37 ° C med mild omrystning. Replace de fortyndede antistof løsninger på dag 2. </li></ol></li><li> For 1- til 2 mm tykt skåret hjernevæv: Prøven inkuberes natten over eller i op til 1 dag i en 0,5- til 1-ml mængde antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for collagen type IV-antistof ved 37 ° C med mild omrystning. <ol><li> Vask prøven i en 15 ml konisk rør med en 12-ml volumen af ​​0,1 x PBS i 1-2 timer. Skift bufferen hver time. </li><li> Prøven inkuberes i et 0,5- til 1-ml mængde antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for Cy3-konjugeret anti-kanin sekundært antistof natten over eller i op til 1 dag ved 37 ° C med mild omrystning. </li></ol></li><li> Vask prøven i 0,1x PBS til stillingen 3 - 5 timer; ændre puffer hver time. </li><li> Før billeddannelse, inkubere prøven i en passende mængde af CUBIC-mount opløsningen i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrystning. Erstat med frisk CUBIC-mount-opløsning og inkuberes i yderligere 1 time. NOTE: </b&gt; 76 type antistoffer fungerede godt i muse ACT-forarbejdede væv, herunder 31 monoklonale antistoffer 14. Pre-mærket væv kan kombineres med immunmærkning af to flere fluorochromer i ACT-forarbejdede væv. </li></ol> 6. immunolabeling af Tætte væv (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO BEMÆRK: c-PRESTO er velegnet til små prøver, såsom hele testikel, hel nyre eller mindre dele af større organer. <ol><li> Overfør prøven i et 1,5-ml rør, tilsæt 500 pi antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for collagen type IV-antistof, og centrifugeres røret ved 600 x g i 2 timer. </li><li> Vask farvede prøve med 0,1 x PBS ved centrifugering ved 600 x g i 30 min. </li><li> Der tilsættes 500 pi af antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for Cy3-konjugeret anti-kanin sekundært antistof og der centrifugeres ved 600 x g i 2 timer. </li><li> Vask farvede prøve med 0.1x PBS ved centrifugering ved 600 x g i 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO BEMÆRK: s-PRESTO er velegnet til større væv. <ol><li> Forbered en sprøjte (30 ml volumen) og tilslut den til en 3-vejs ventil (figur 1A). Lim ventilen med en limpistol til high-trykforhold (Figur 1B). </li><li> Overfør prøven i 3-vejs ventil-forbundet sprøjte i den lukkede ventilstilling. </li><li> Tilsæt 5 - 7 ml af antistof fortynding opløsning med en fortyndingsfaktor på 1/500 for collagen type IV-antistof. Slip antistofopløsningen ind i prøven ved at åbne ventilen. </li><li> Sæt sprøjten stemplet til 17-ml position til at give tilstrækkelig plads til infusion / tilbagetrækning bevægelse. Dette kan gøres i det åbne ventilposition. Luk 3-vejsventilen efter indstillingen sprøjte er færdig. </li><li> Sæt sprøjten med prøven på en sprøjtepumpe. Indstil sprøjtepumpen på en infusion / tilbagetrækning volumen på 10 ml / min og en 4-min pausetid på kontinuerlig cyklus (figur 1C). BEMÆRK: Pumpen tilfører indtil den når målet volumen (10 ml), og derefter strømningsretningen ændringer efter en kort pause (4 min). </li><li> Kør sprøjtepumpen i 3 - 24 timer ved stuetemperatur (figur 1F). </li><li> Åbn 3-vejs ventil og erstatte opløsningen med 0,1 x PBS. </li><li> Vask farvede prøve to gange med 0,1 x PBS i 1 time hver gang anvendes sprøjtepumpen. </li><li> Skift med antistof fortynding opløsning indeholdende Cy3-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (fortyndingsfaktor af 1/500) og køre sprøjtepumpen i 3 - 24 t. </li><li> Åbn 3-vejs ventil og erstatte opløsningen med 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Før billeddannelse, inkubere den farvede prøve i en passende mængde af CUBIC-mount opløsningen i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrystning. Erstat med frisk CUBIC-mount-opløsning og inkuberes i yderligere 1 time. </li></ol> 7. jegmaging <ol><li> Placer mærket væv i et konfokalt skål og tilsæt CUBIC-mount-opløsning indtil vævet er dækket. Placer et dækglas på vævet. Brug et konfokalt mikroskop til billedet vævet 14 under 10X-objektivet. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Dårlig fiksering eller hydrogel nedsænkning i væv kan forårsage tab af proteiner og fordrejning af væv under vævet clearingen. Hele den voksne musehjerne inkuberes i 4% paraformaldehyd natten over, efterfulgt af nedsænkning i et minimalt volumen på 20 ml hydrogel monomer opløsning i 12 - 18 timer med forsigtig omrystning. For store væv, herunder humant væv såsom hjernen skiver og rygmarv, forlænget neddypning tid i hydrogelen monomeropløsningen er påkrævet. ACT-protokollen er let anvendelig til rydning af faste væv, fordi vævet fiksering og polymer infusionssæt trin adskilles. Efter væv clearing blev humane væv well-farvet med flere antistoffer. Bemærk, at ACT Skrabningsteknikken er ikke kompatibel med alkohol fikseringsmidler, såsom ethanol og methanol. Vævet-hydrogel polymeriseringstrin er også kritisk at producere god kvalitet væv efter clearingprocessen. Fordioxygen hæmmer polymerisation af acrylamid, bør den fjernes ved afgasning af væv-holdige opløsning under en infusion nitrogengas system. Alternativt kan de-oxygenering udføres under anvendelse af en vakuumkammer med en varmeblok i 23 timer. Den clearing sats er afhængig af en lang række faktorer, herunder orglet størrelse, indholdet af lipider eller ECM fibrøse proteiner, tilstanden af fiksering mv De fleste voksne mus væv kan ryddes ved ETC natten over. Der er imidlertid en risiko for unødvendig over-clearing og væv hævelse; således er forskellene i clearing tid er af vigtig overvejelse. Tissue-clearing betingelser skal være empirisk. Vigtigt er det, kan indholdet af ECM påvirke udseendet af den blokerede væv. Farven på væv forbliver hvide eller uigennemsigtig, selv efter ACT i ETC buffer, fordi ACT ikke afhjælper tætte proteinfibre. Hvis disse organer blev nedsænket i RI matching opløsning, deny blev gennemsigtigt. Hastigheden af ​​væv hævelse synes at være afhængig af ECM indholdet af væv og bløde organer, såsom hjernen, udviser en større kvældningsgrad end tætte organer. Fordi øget væv hævelser vil hjælpe væv-clearing procedure, ACT rutinemæssigt udnytter destilleret vand-baserede buffer i de fleste tilfælde. I nogle tilfælde, når væv ekspandering eller forbigående deformitet er ikke ønskeligt, såsom i embryoner, buffer, der indeholder 0,1 x PBS kan anvendes til høj opløsning billeddannelse. Det bør også bemærkes, at højere koncentrationer salt i bufferen kan forårsage krympning af væv. ACT metode kan klarlægge hele organer og endda hele kroppen af en mus 14. Imidlertid dybtliggende væv billeddannelse af gennemsigtige væv kræver særlige mikroskoper og mål. Således hjernevæv 1- til 2 mm tykt er mest effektiv for billeddannelse med en konventionel konfokal mikroskop. I vores hænder, fjernelse af etikettened antistoffer fra ACT-forarbejdede væv er antistof-afhængig, og runder af forskellige antistof mærkning anbefales ikke. Adskillige antistoffer, såsom TH og GFAP, fungeret specielt godt for hel-hjerne immunolabeling 14. På den anden side er nogle antistoffer, såsom TUJ1 eller Map2, ofte mærket kun overfladen af ​​vævet. Dette kan forbedres ved andre metoder, såsom SWITCH 15. En anden potentiel begrænsning er, at det kan være vanskeligt at bevare fine proteinstrukturer i ACT-forarbejdede væv på grund af vævet hævelse og krympning under vævs-clearing trin. Presto teknik er anvendelig til en bred vifte af væv-mærkning teknikker. For eksempel i vævs-transparente metoder under anvendelse af præ-mærkede væv, såsom SeeDB 4 og iDISCO 7, immunmærkning af tæt væv kræver inkubationsperioder længere end adskillige dage til uger. Imidlertid kan PRESTO forkorte inkubationstiden til flere timer, eKTIVERING færdiggørelsen af ​​hele processen inden for en dag med 1 mm tyk tætte væv. PRESTO kan øge effektiviteten af ​​dyb-mærkning tykt, tætte væv, eller endda un-clearede tykke væv. Fordi PRESTO bruger en bordplade centrifuge eller sprøjtepumpe og ikke kræver særligt udstyr, er det relativt let at implementere denne teknik med rutinemæssige lab procedurer.

En af udfordringerne i neurovidenskab er visualiseringen af ​​neuronal kredsløb ledninger og individuelle celler i intakt hjernevæv. Indtil for nylig, viser forbindelserne mellem neuronerne på denne måde kræves en) seriel sektionering af væv; 2) molekylær mærkning af specifikke mål, såsom axoner eller proteiner; og 3) visualisering af 3D-rekonstruktion af hele hjernen via beregningsmæssige registrering eller tilpasning af 2D serielle billeder 1. Disse trin er besværlig, kræver en hel del tid, og risikerer at miste information under sektionering og mærkning, hvilket gør neuronal netværk mapping overordentlig vanskelig. Men mange metoder, der tillader visualisering af intakt væv uden sektionering blevet udviklet. Biologiske væv kan gøres optisk transparent ved væv-clearing teknikker 2-10. En af de store metoder er at reducere brydningsindeks forskelle mellem det intakte væv og el opløsningen forat reducere lysspredning i det intakte væv, hvilket således gør vævet gennemsigtig og muliggør observation af dybe strukturer. Nogle typer af nedsænkning løsninger har hydrofobe egenskaber, som resulterer i hurtig fluorescerende quenching under tørringen procedure. Derfor disse metoder er ikke kompatible med fluorescerende billeddannelse over en lang tidsperiode 11,12. I stedet for hydrofobe reagenser, andre fremgangsmåder anvender hydrofile reagenser til væv clearing, såsom SeeDB 4 og Sca l e 6, der bevarer de strukturelle information og fluorescens af det biologiske væv 4,6,8. Imidlertid makromolekyler, herunder antistoffer, ikke kan nå kernen i intakt væv ved diffusion alene. Derfor er den før-mærkning af målmolekyler i dybe områder af tætpakket væv er teknisk udfordrende. I et nyligt udviklet væv-clearing metode, CLARITY 3, en hydrogel-indlejret biologisk væv is dannet med acrylamid, og lipider fjernes ved elektroforese under natriumdodecylsulfat (SDS) holdig opløsning. Prøven nedsænkes derefter i en opløsning med en matchende reflekterende indeks til at reducere lys spredning 3. Det lipid fjernelse system blev senere ændret i avanceret CLARITY 13 og PACT (passiv klarhed teknik) 10. Efter polymerisering acrylamid kæder tværbinde med proteiner, der danner hydrogel-væv. Lipidbestanddele kan ikke tværbinder med acrylamid; således kan lipider fjernes ved elektroforese under SDS-holdig buffer. Gennem aktiv fjernelse af lipider, hjernevæv markant øger gennemsigtighed 9. Men disse metoder ikke løse umuligheden af ​​dyb-mærkning ved fri diffusion. For at overvinde denne begrænsning, er teknikker til den aktive transport af reagenser i de dybeste dele af tykke væv kræves. Selvom CLARITY tillader væv clearing og dybt vævvisualisering, er det ikke en let eller hurtig procedure. Det kan tage flere uger at rydde en hel musehjerne 7,14. Hurtig rydning af væv er afgørende for anvendelsen af ​​disse metoder til grundlæggende eller klinisk laboratorie indstillinger for life science forskning eller volumen diagnose. Den nuværende protokol giver en forenklet proces for biologisk væv clearance og efterfølgende protein detektion ved tryk-assisteret levering immunfarvning. Den er velegnet til høj opløsning volumen billeddannelse af store arkiveret og 3D databehandlingssystemer gennem kombination med billeddiagnostiske metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Identifikation og udforskning af den detaljerede organisering af organer eller af hele kroppen på celleniveau er grundlæggende udfordringer i biologi. Overgangsbestemmelser metoder kræver en betydelig mængde tid og kræfter på at opnå et 3D-billede og med sektionering den intakte væv, immunolabeling, og billedbehandling serielt-delt væv, der producerer et tab af information på hvert trin i processen. I nyligt udviklede metoder til høj opløsning billeddannelse inden intakt væv, er molekylær karakterisering været begrænset til mærkning af proteiner. Men aktuelt tilgængelige protokoller for orgel clearing kræve en betydeligt lang procestid, hvilket gør det vanskeligt at gennemføre væv clearing teknikker i laboratoriet. Vi etablerede for nylig en hurtig og yderst reproducerbar protokol betegnes ACT-PRESTO (en ctive c rigtighed t echnique- p ressure r opstemt e fficient og s tabel t ransferaf makromolekyler i o rgans), som giver mulighed for væv clearance løbet af nogle timer. Desuden ACT-PRESTO muliggør hurtig immunolabeling med konventionelle metoder og accelererer antistof indtrængen i det dybe lag af tæt-formede, tykke prøver ved at anvende pres eller konvektion flow. Vi beskriver hvordan man forbereder væv, hvordan at rydde ved lipid fjernelse ved hjælp af elektroforese, og hvordan man immun-pletten ved et tryk-assisteret levering. Den hurtighed og konsekvens af protokollen vil fremskynde udførelsen af ​​3D histologisk forskning og volumenbaserede diagnoser.

ACT-væv Clearing En vigtig faktor, der påvirker væv clearing er vævsfiksering. PFA fiksering og acrylamid infusion er separate skridt i denne protokol. Efter vævet-hydrogel polymerisationstrin, er den frie A4P0 løsning ikke polymeriseret, selvom væv-infused hydrogeler er tværbundet med endogene makromolekyler. Der bør derfor ikke gel danne ydersiden af væv (figur 2A). Loven procedure resulterer i mindre krydsbinding mellem proteiner og acrylamid i forhold til CLARITY-protokollen. Følgelig vævet-hydrogel prøve er mere porøst. Denne funktion gør det muligt hurtigt udvinding af lipider og udbredelse af makromolekyler. Sektioner af musehjerne 1- til 2 mm tykt var tilstrækkeligt blokerede inden for 1 - 2 timer (Figur 2B), og 5 - 6 timer ETC var tilstrækkeligt for clearance af hele musehjerner (figur 2C). Hydrogel-medieret væv clearing inducerede udvidelse af vævet efter ETC skridt, men vævet tilbage til sin oprindelige størrelse i reflekterende indeks-matchede løsning. Vævet-hydrogel prøve dannet i ACT procedure er meget porøse, og dermed kan små forbindelser og makromolekyler trænger effektivt og diffunderer let (figur 3). Efter en 2-timers inkubation af 1-mm hjerneskiver med tyrosin hydroxylase (TH) og collagen type IV-antistof, en efterfølgende 2-timers inkubation med et sekundært antistof var tilstrækkelig til at mærke dopaminerge neuroner på en 500 um dybde (figur 3) . PRESTO-væv immunolabeling Tætte organer generelt har høje koncentrationer af ECM fibre, hvilket påvirker indtrængen af ​​antistoffer ind i vævene. Således antistoffer Penetvurderet til en dybde på kun 20-30 um i tætte væv, såsom nyrevæv, efter 12 h inkubation. For at overvinde denne begrænsning, vi designet aktive makromolekyle penetration metoder, der muliggør tilsætning af reagenser i dybe væv, nemlig PRESTO (trykrelateret effektiv og stabil overførsel af makromolekyler ind i de organer) (figur 4). Sammenlignet med den statiske inkubation af ACT-forarbejdet nyrevæv med antistofopløsninger, anvendelse af centrifugalkræfter (600 xg) med en bordplade centrifuge (centrifugal PRESTO, c-PRESTO) stærkt forbedret antistof levering i dybe væv (figur 5). Når vi anvendte c-PRESTO procedure til tætte væv, 3 h inkubation var tilstrækkelig til at mærke 250- til 300-um dybe strukturer. For at forbedre vævsdistortion uden væsentlig vævsbeskadigelse, vi også designet en maskine, der giver konvektion flow med en sprøjtepumpe (sprøjte PRESTO, s-PRESTO). Denne proces tilsvarende forbedret antistof-penetration sammenlignet med passiv diffusion (figur 5). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figur 1. Fremstilling af s-PRESTO-apparatet. A. En sprøjte (30 ml) og tre-vejs stophane. B. De tre-vejs stophane tilsluttet og limet til sprøjten. C. sprøjte indeholdende prøven og antistofopløsningen, og sprøjten placeres på sprøjtepumpen. D. Sprøjten pumpe og arbejdsvilkår setup. E. Pumpen tilfører en opløsning indeholdende mærkningsreagenserne i prøven. Når den udpegede volumen er nået, pumpning retningsændringer og trækker opløsningen efter en udpeget tidsperiode. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Figur 2. ACT væv rydning af musehjerne. A. Efter polymerisering, er gratis A4P0 løsninger ikke polymeriseret; væv-infunderes hydrogeler er gelerede ved krydsbinding med endogene makromolekyler. B. 1- til 2-mm tykke hjernen skiver blev ryddet for 1 - 2 timer, og omfanget af ekspansion og størrelse opsving i reflekterende indeks (RI) -matching opløsning blev registreret. C. Tykkelsen af hele muse hjerne er omkring 0,8 cm og 5 - 6 timer ETC blev tilstrækkelig til fuldstændigt klart hjernen. Efter 3 timer af ETC, var der en signifikant mængde ikke-blokerede væv. Ved 6 timers ETC imidlertid rydning af hele hjernen havde fundet sted. Farven på væv efter ACT i ETC bufferen er hvid eller uigennemsigtig. Af RI justering, væv bliver gennemsigtig. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Klik hende</a>e for et større version af denne figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figur 3. immunolabeling med ACT-ryddet mus hjernevæv. Billeder af ACT-forarbejdet 1 mm muse hjerneskiver viser musehjerne cortex farvet med et antistof mod collagen type IV og en del af midthjernen farvet med et antistof mod tyrosin hydroxylase (TH). Scale bar, 100 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figur 4. PRESTO immunolabeling metoder. Antistoffer kan ikke trænge ind i tætte væv ved diffusion. PRESTO immunolabeling metoder blev designet til aktivt infusere makromolekyler og levere reagenser tiltætte væv. Anvendelsen af ​​centrifugalkræfter under anvendelse af en standard bordplade centrifuge (centrifugal PRESTO, c-PRESTO) tydeligt lettet leveringen af ​​antistoffer. Appling konvektion flow med en sprøjte pumpe (sprøjte PRESTO, s-PRESTO) forbedret antistof penetration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figur 5. PRESTO immunolabeling af ACT-ryddet tætte væv. For c-PRESTO blev væv centrifugeres ved 600 xg i 3 h ved hjælp af en standard bordplade centrifuge for at fremskynde udbredelsen af ​​primære og sekundære antistoffer. For s-PRESTO, blev en sprøjtepumpe anvendes til at levere antistofferne. Mus organer, såsom nyrerne og leveren, blev mærket med collagen type IV. Sammenlignet med konventionelle metoder, 3H afc- eller s-PRESTO markant øger dybden mærkning. I nyrerne og leveren, dybden af ​​Z-aksen kommer ned på 300 - 350 um eller dybere i PRESTO prøver (højre), mens kontrolprøver er mærket i en dybde på kun 40 - 50 um (venstre). En 3D rekonstruerede billede blev opnået med et konfokalt mikroskop. Scale bar, 100 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (aktiv klarhed teknik-pres relateret effektiv og stabil overførsel af makromolekyler i organer) muliggør hurtig, effektiv, men billig væv clearing og hurtig antistof indtrængen i ryddet væv ved passiv diffusion eller tryk-assisteret levering. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, kan en lang række væv blive ryddet, immunolabeled af flere antistoffer, og volumen-afbildes.

ACT-PRESTO: Biologisk Tissue Clearing og immunolabeling Metoder til Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volumen segmentering og analyse af biologiske materialer ved hjælp af SuRVoS (Super-regionen volumen segmentering) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Ægekstraktpræparation og levende billeddannelsesmetoder til visualisering af dynamisk cytoplasmisk organisation

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk rydning af plantevæv til fluorescensbilleddannelse

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...