Name: act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Dyreforsøk må følge alle relevante statlige og institusjonelle regelverk. 1. Utarbeidelse av reagenser <ol><li> For den hydrogel monomeroppløsningen (A4P0): Tilsett 20 g akrylamid i 450 mL 0.1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og justere volumet til 500 ml med 0.1x PBS. FORSIKTIG: akrylamidmonomerer er giftige. Utfør alle prosedyrer i en avtrekkshette med personlig verneutstyr, inkludert en ansiktsmaske, en laboratoriefrakk, hansker, og lukket-toe sko. <ol><li> Umiddelbart før bruk tilsettes 100 mg 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propan] dihydroklorid i 40 ml hydrogel monomer oppløsning (A4P0) i et 50 ml konisk rør under en avtrekkshette . </li></ol></li><li> For den elektroforetiske vev clearing (ETC) buffer: til 40 g natriumdodecylsulfat (SDS) og 12,37 g av borsyre til 800 ml avionisert H 2 O (dH 2 O). Juster pH til 8,5 med NaOH og justere volumet til1 L med ekstra dH 2 O. FORSIKTIG: SDS er et skadelig kjemisk; Derfor må den behandles med forsiktighet. </li><li> For den kubiske montert løsning: Tilsett 250 g sakkarose, 125 g urea og 125 g N, N, N &#39;, N&#39; N&#39;-tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamin i 150 ml dH 2 O og bringe volumet til 500 ml med dH 2 O. </li></ol> 2. Prøvepreparering og Fiksering <ol><li> Avliving av musen. <ol><li> Klargjør alfaxalone (1 mg / kg) og xylazin (0,5 mg / kg) i samme sprøyte. </li><li> Intraperitonealt injisere blanding av alfaxalone og xylazin og tillate 3 min for musen å bli bevisstløs. </li><li> Vent til bedøvede mus reagerer ikke lenger smertefulle stimuli, for eksempel en hale knipe, før du fortsetter. FORSIKTIG: Følg hensiktsmessige institusjonelle retningslinjer for håndtering av dyr. </li></ol></li><li> Tran perfuse musen med 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) løsninginneholdende heparin (100 U / ml) for å exsanguinate, etterfulgt av 100 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4) 14. FORSIKTIG: PFA løsning er giftig. Utarbeidelse av PFA løsning og alle påfølgende håndtering må foretas i en avtrekkshette og med personlig verneutstyr. </li><li> Skjær av musen hodet, åpne opp huden, og bryte skallen mellom øynene ved hjelp av små saks. </li><li> Fjern deler av kraniet ved hjelp av små, buede tang. </li><li> Ta ut hjernen eller ønskede organer. </li><li> Inkuber hjernen og organer i post-fix 4% PFA løsning ved 4 ° C over natten. MERK: For spesifikk-regionen vev clearing, dissekere bestemt region eller trimme vevet etter vev fiksering. FORSIKTIG: PFA løsning er giftig. Den transcardial perfusjon og alle påfølgende mus håndtering må foretas i en avtrekkshette og med personlig verneutstyr. </li></ol> 3. Hydrogel Monomer Infusion og Polymerization <ol><li> Inkuber de faste organene i A4P0 hydrogel monomer løsning ved 4 ° C i 12-24 timer med forsiktig risting. </li><li> Hydrogel monomer-tilført vev polymerisasjon. <ol><li> Overføre prøven til en 10 ml rundbunnet rør med 5 ml av hydrogelen monomer løsning. Pakk toppen av rundbunnet rør med Parafilm. </li><li> Fjerne oksygenet fra rundbunnet rør inneholdende hydrogel-tilført hele musehjerneprøve ved å boble nitrogen gjennom væsken i 1 min. Hurtig og tett lukke prøve-inneholdende rør. </li></ol></li><li> Overføre røret til et vannbad (37 ° C) i 2 timer. </li><li> Vask den polymeriserte prøven kort med 0.1x PBS for å fjerne overskudd av hydrogel. FORSIKTIG: Hydrogel monomerer er giftige. For å unngå hudkontakt med hydrogel monomer, utføre alle prosedyrer i en avtrekkshette og med personlig verneutstyr, inkludert en ansiktsmaske, en laboratoriefrakk og hansker. MERK: polymeriserte vevkan lagres i 0.1x PBS som inneholder natriumazid for mer enn 2 uker ved 4 ° C. FORSIKTIG: Natriumazid er høyt og akutt giftig. Utfør alle prosedyrer i en avtrekkshette og med personlig verneutstyr, inkludert en ansiktsmaske, en laboratoriefrakk og hansker. </li></ol> 4. Elektro Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Overfør den polymeriserte prøven til en vev container og plassere vevet beholder i ETC kammeret. </li><li> Fyll ETC kammer med ETC buffer ved hjelp peristatic pumpe. </li><li> Sett ETC forholdene og kjøre ETC. Bruk følgende innstillinger. <ol><li> For ETC innstillinger for hele organer, kan du bruke følgende innstillinger: (1,5 amp), temperatur (37 ° C), kjøretid (6,0 t), pumpehastighet (30 rpm). </li><li> For ETC innstillinger for 1 til 2 mm tykke mus hjernen skiver, bruk følgende innstillinger: strøm (1,5 amp), temperatur (37 ° C), kjøretid (2,0 t), pumpehastighet (30 rpm). </li></ol></li><li> Transfer than erte prøve til en 50 ml konisk rør med 45 ml 0.1 x PBS. Vask ryddet prøve flere ganger med 0.1x PBS inntil ingen bobler er sett når røret er kort rystet (for å bekrefte fullstendig fjerning av SDS). </li></ol> 5. Immunolabeling av ACT-behandlet vev <ol><li> For mus hele hjernen: Inkuber prøven i en 3-ml volum av antistoff-oppløsning inneholdende 1 x PBS, 6% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100 og 0,01% natriumazid (antistoff-fortynning oppløsning) med en fortynning faktor på 1/500 for tyrosinhydroksylase (TH) antistoff i 4 dager ved 37 ° C med mild risting. Sett på antistoffløsning på slutten av dag 2. <ol><li> Vask prøven i en 50 ml konisk rør med 45 mL 0.1x PBS i 3 - 5 timer og forandre bufferen hver time. </li><li> Inkuber prøven i en 3-ml volum av antistoff-fortynning oppløsning med en fortynningsfaktor på 1/500 for esel anti-kanin-sekundært antistoff 488 i 4 dager ved 37 ° C med mild risting. repless de fortynnede antistoff løsninger på dag to. </li></ol></li><li> For 1 til 2 mm tykke skiver hjernevev: Inkuber prøven over natten eller i opp til 1 dag i et 0,5- til 1-ml volum av antistoff-fortynning oppløsning med en fortynningsfaktor på 1/500 for kollagen type IV-antistoff ved 37 ° C med mild risting. <ol><li> Vask prøven i en 15 ml konisk rør med en 12-ml volum av PBS 0.1x i 1-2 timer. Endre buffer hver time. </li><li> Inkuber prøven i et 0,5- til 1-ml volum av antistoff-fortynning oppløsning med en fortynningsfaktor på 1/500 for Cy3-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff over natten eller inntil en dag ved 37 ° C med mild risting. </li></ol></li><li> Vask prøven i 0.1x PBS i 3-5 timer; forandre bufferen hver time. </li><li> Før avbildning, inkubere prøven i en passende mengde av kubisk mount løsning i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Erstatt med fersk CUBIC-mount løsning og inkuberes i ytterligere 1 time. NOTAT: </b&gt; 76 type antistoffer fungert bra i mus ACT-behandlet vev, inkludert 31 monoklonale antistoffer 14. Pre-merkede vev kan kombineres med den immunolabeling av to fluorokromer i ACT-behandlet vev. </li></ol> 6. Immunolabeling av tett vev (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO MERK: c-PRESTO er egnet for små-sized prøver, som hele testis, hele nyre eller små deler av større organer. <ol><li> Overfør prøven inn i et 1,5-ml tube, tilsett 500 pl av antistoffløsningen fortynning med en fortynningsfaktor på 1/500 for kollagen type IV-antistoff, og sentrifuger røret ved 600 x g i 2 timer. </li><li> Vask farget prøve med 0.1x PBS ved sentrifugering ved 600 x g i 30 min. </li><li> Legg 500 ul av antistoff-fortynning oppløsning med en fortynningsfaktor på 1/500 for Cy3-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff og sentrifuger ved 600 x g i 2 timer. </li><li> Vask farget prøven med 0.1 x PBS ved sentrifugering ved 600 x g i 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO MERK: s-PRESTO er egnet for større vev. <ol><li> Forbered en sprøyte (30 ml volum) og koble den til en 3-veis ventil (figur 1A). Lim ventilen med limpistol for høyt trykkforhold (Figur 1b). </li><li> Overfør prøven inn i tre-veisventil koblet sprøyten i den lukkede ventilposisjon. </li><li> Tilsett 5 - 7 ml av antistoff-fortynning oppløsning med en fortynningsfaktor på 1/500 for kollagen type IV antistoff. Slipp antistoffløsning i prøven ved å åpne ventilen. </li><li> Sprøyten stempelet til den 17-mL stilling for å tilveiebringe tilstrekkelig rom for tilførsel / uttak bevegelse. Dette kan gjøres i den åpne ventilstilling. Steng 3-veisventilen etter at sprøyten innstillingen er ferdig. </li><li> Sette sprøyten inneholdende prøven på en sprøytepumpe. Setter sprøytepumpe betingelser til en tilførsel / uttak volum på 10 ml / min og et 4-min pause tid på kontinuerlig syklus modus (figur 1C). MERK: Pumpen tilfører til den når mål-volum (10 ml), og deretter strømningsretningen endres etter en kort pause (4 min). </li><li> Kjør sprøytepumpe i 3 - 24 timer ved romtemperatur (figur 1F). </li><li> Åpne 3-veis ventil og erstatte løsning med 0.1x PBS. </li><li> Vask farget prøven to ganger med 0.1x PBS i 1 time hver gang du bruker sprøytepumpen. </li><li> Endre med antistoff fortynning løsning som inneholder Cy3-konjugert anti-kanin sekundært antistoff (fortynning faktor på 1/500) og kjører sprøytepumpen for 3-24 timer. </li><li> Åpne 3-veis ventil og erstatte løsning med 0.1x PBS. </li></ol></li><li> Før avbildning, inkuber farget prøven i en passende mengde av kubisk mount løsning i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Erstatt med fersk CUBIC-mount løsning og inkuberes i ytterligere 1 time. </li></ol> 7. jegmaging <ol><li> Plasser merket vev i en confocal tallerken og legg CUBIC-mount løsning inntil vevet er dekket. Plassere et dekkglass på vevet. Bruk en konfokalmikroskop til bilde vevet 14 under 10X objektiv. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Dårlig fiksering eller hydrogel nedsenking inn i vev kan føre til tap av proteiner og forvrengning av vevet i løpet av vev clearing prosessen. Hele voksen musehjerne bør inkuberes i 4% paraformaldehyd over natten, etterfulgt av nedsenking i et minimalt volum 20 ml hydrogel monomer løsning i 12 - 18 timer med forsiktig risting. For store vev, inkludert humant vev så som hjerneskiver og ryggmargen, utvidet soaking tid i hydrogelen monomerløsningen er nødvendig. ACT-protokollen er lett anvendelig til clearing av faste vev fordi vev fiksering og polymer infusjons trinn er separert. Etter vev clearing, menneskelig vev var godt farget med flere antistoffer. Legg merke til at ACT clearing teknikken er ikke kompatibel med alkohol fiksativ, slik som etanol og metanol. Vevet-hydrogel polymerisasjonstrinn er også avgjørende for å produsere god kvalitet vev etter clearing prosessen. Fordioksygen hemmer polymeriseringen av akrylamid, bør det fjernes ved avgassing av vev-inneholdende oppløsning under en nitrogengass-infusjonssystem. Alternativt kan de-oksygenering utføres ved hjelp av et vakuumkammer med en varmeblokk i 23 timer. Clearing hastighet er avhengig av en rekke faktorer, blant annet orgel størrelse, innholdet av lipider eller ECM fibrøse proteiner, tilstanden til fiksering, etc. De fleste voksne mus vev kan rettes opp av ETC over natten. Men det er en fare for unødvendig over-clearing og vev hevelse; dermed forskjellene i clearing tid er av viktig faktor. Tissue-clearing forhold bør bestemmes empirisk. Viktigere, kan innholdet i ECM påvirke utseendet av det klargjorte vev. Fargen på vev forblir hvit eller ugjennomsiktig, selv etter at ACT i ETC buffer, fordi ACT ikke løser tette protein fiber. Imidlertid, når disse organene ble neddykket i RI samsvarende løsning, deny ble gjennomsiktig. Hastigheten av vev svellingen synes å være avhengig av ECM-innholdet i vev, og myke organer, slik som hjerne, oppviser en større svelling forhold enn tette organer. Fordi økt vev hevelse vil hjelpe vev-clearing prosedyre, ACT rutinemessig benytter destillert vann-basert buffer i de fleste tilfeller. I noen tilfeller, når vev hevelse eller forbigående misdannelse er ikke ønskelig, for eksempel i embryoer, buffer som inneholder 0.1x PBS kan brukes for høy oppløsning bildebehandling. Det bør også bemerkes at høyere saltkonsentrasjon i bufferen kan føre til krymping av vev. ACT metoden kan avklare hele organer og til og med hele kroppen av en mus 14. Men dypt vev avbildning av gjennomsiktig vev krever spesielle mikroskoper og målsettinger. Således er hjernevev 1 til 2 mm tykke mest effektive for avbildning med en konvensjonell konfokalt mikroskop. I våre hender, fjerning av etikettened antistoffer fra ACT-behandlet vev er antistoffavhengig, og runder med forskjellige antistoff merking anbefales ikke. Flere antistoffer, så som TH og GFAP, virket spesielt godt for hel-hjerne immunolabeling 14. På den annen side er det enkelte antistoffer, så som Tuj1 eller Map2, ofte kalt bare overflaten av vevet. Dette kan forbedres ved andre metoder, slik som SWITCH 15. En annen potensiell begrensning er at det kan være vanskelig å bevare gode proteinstrukturer i ACT-behandlet vev på grunn av vevet svelling og krymping under den vev-clearing trinn. Presto teknikk er anvendbar på et bredt utvalg av vev-merkingsteknikker. For eksempel, i vev-gjennomsiktig metoder ved hjelp av pre-merket vev, slik som SeeDB 4 og iDISCO 7, immunolabeling av tett vev krever inkubasjonsperioder lengre enn flere dager til uker. Imidlertid PRESTO kan redusere inkubasjonstiden til flere timer, enabling gjennomføring av hele prosessen i løpet av en dag med 1 mm tykk tett vev. PRESTO kan forbedre effektiviteten av dyp-merking tykk, tett vev, eller til og med un-klarerte tykke vev. Fordi PRESTO bruker en bordsentrifuge eller sprøytepumpe og krever ikke noe spesielt utstyr, er det relativt enkelt å implementere denne teknikken med rutinemessige laboratorieprosedyrer.

En av utfordringene i nevrovitenskap er visualisering av nevronale kretsen og individuelle celler i intakte hjernevev. Inntil nylig, viser forbindelsene mellom nerveceller på denne måten kreves 1) serie seksjonering av vev; 2) Molekyl merking av spesifikke mål, så som axoner eller proteiner; og 3) visualisering av 3D-rekonstruksjon av hele hjernen via beregnings registrering eller justering av 2D seriebilder 1. Disse trinnene er arbeidskrevende, krever mye tid, og er ansvarlig for å miste informasjon under seksjonering og merking, noe som gjør nevronale nettverk kartlegging svært vanskelig. Imidlertid har mange metoder som tillater for visualisering av intakt vev uten seksjonering blitt utviklet. Biologisk vev kan gjøres optisk transparent av vev-clearing teknikker 2-10. En av de viktigste metodene er å redusere brytningsindeks-forskjeller mellom intakt vev og nedsenking oppløsningen i rekkefølgefor å redusere lysspredning i intakt vev, og gjør således vevet transparent og muliggjør observasjon av dype strukturer. Noen typer redningsløsninger har hydrofobe egenskaper, som resulterer i rask fluorescerende slukke under dehydrering prosedyren. Derfor er disse metodene er ikke kompatible med fluoriserende bilde over en lang tidsperiode 11,12. I stedet for hydrofobe reagenser, andre metoder benytte hydrofile reagenser for vev lysning, slik som SeeDB 4 og Sca l e 6, som opprettholder den strukturelle informasjonen og fluorescensen av det biologiske vev 4,6,8. Imidlertid makromolekyler, inkludert antistoffer, kan ikke nå kjernen i intakt vev ved diffusjon alene. Derfor er den pre-merking av målmolekyler i dype områder av tett-pakket vev teknisk utfordrende. I en nylig utviklet vev-clearing metode, CLARITY tre, en hydrogel-embedded biologisk vev is dannes med akrylamid, og lipidene blir fjernet ved elektroforese i henhold natriumdodecylsulfat (SDS) -holdig oppløsning. Prøven blir deretter nedsenket i en løsning med en samsvarende reflekterende indeks for å redusere lysspredning 3. Den lipid fjerning systemet ble senere endret i avansert CLARITY 13 og PACT (passiv klarhet teknikk) 10. Etter polymerisering, akrylamid kjeder crosslink med proteiner, danner hydrogel-vev. Lipid-komponenter kan ikke crosslink med akrylamid; således kan lipidene bli eliminert ved elektroforese i henhold til SDS-holdig buffer. Gjennom aktiv eliminering av lipider, øker hjernevev markert i åpenhet 9. Men disse metodene ikke ta det umulige i deep-merking av fri diffusjon. For å overvinne denne begrensningen, er teknikker for aktiv transport av reagenser inn i de dypeste delene av tykke vev nødvendig. Selv CLARITY tillater vev clearing og dype vevvisualisering, er det ikke en lett eller hurtig prosedyre. Det kan ta flere uker å tømme en hel musehjerne 7,14. Rapid clearing av vev er avgjørende for anvendelsen av slike metoder for grunnleggende eller klinisk laboratorium innstillinger for life science forskning eller volum diagnose. Den nåværende protokollen gir en forenklet prosess for biologisk vev klarering og påfølgende protein deteksjon av trykk-assistert levering immunofarging. Det er egnet for høy oppløsning volum avbildning av store arkivert og 3D databehandlingssystemer gjennom kombinasjon med avbildningsmetoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Identifiseringen og utforskning av den detaljerte organiseringen av organer eller av hele kroppen på cellenivå er grunnleggende utfordringer i biologi. Overgangs metoder krever en betydelig mengde av tid og krefter på å skaffe en 3D-bilde og med seksjonering av intakt vev, immunolabeling, og avbildning serielt kåret vev, som frembringer et tap av informasjon på hvert trinn i prosessen. I nylig utviklet metoder for høyoppløselig avbildning innen intakt vev, har molekylær karakterisering vært begrenset til merking av proteiner. Men for tiden tilgjengelige protokoller for orgel clearing krever en betydelig lang prosess tid, noe som gjør det vanskelig å gjennomføre vev clearing teknikker i laboratoriet. Vi har nylig etablert en rask og svært reproduserbare protokoll kalt ACT-PRESTO (a ctive c regularitet t echnique- p rykk r opprømt e fficient og s bord t ransferav makromolekyler i o rgans), som gjør det mulig for vev klaring i løpet av flere timer. Videre gjør ACT-PRESTO rask immunolabeling med konvensjonelle metoder og akselererer antistoff penetrasjon inn i den dype lag av tett-formet, tykke prøvene ved å legge press eller konveksjon flyt. Vi beskriver hvordan å forberede vev, hvordan å rydde av lipid fjerning ved hjelp av elektroforese, og hvordan du Immuno-flekke av en trykkassistert levering. Den hurtighet og konsistens av protokollen vil fremskynde utviklingen av 3D histologisk forskning og volumbaserte diagnoser.

ACT-vev Clearing En viktig faktor som påvirker vev clearing er vev fiksering. PFA fiksering og akrylamid infusjon er separate trinn i denne protokollen. Etter vev-hydrogel polymerisasjonstrinn er gratis A4P0 løsningen ikke polymerisert, selv vev-tilført hydrogeler er tverrbundet med endogene makromolekyler. Derfor bør det ikke danne gel utsiden av vev (figur 2A). Loven prosedyren resulterer i mindre kryssbinding mellom proteiner og akrylamid i forhold til CLARITY protokollen. Følgelig er vevet-hydrogel prøve mer porøs. Denne funksjonen gjør det mulig for rask utvinning av lipider og diffusjon av makromolekyler. Deler av mus hjernen 1 til 2 mm tykke, ble tilstrekkelig fjernet i løpet av 1 - 2 timer (figur 2B), og 5. - 6. time av ETC var tilstrekkelig for clearance av hele mus hjernen (Figur 2C). Hydrogel-mediert vev clearing indusert utvidelse av vev etter ETC skritt, men vevet tilbake til sin opprinnelige størrelse i reflekterende indeks matchet løsning. Vevet-hydrogel prøven dannet i den ACT fremgangsmåte er meget porøs og således kan små forbindelser og makromolekyler trenge effektivt og lett diffunderer (figur 3). Etter en 2-timers inkubasjon av 1 mm hjernesnitt med tyrosin hydroksylase (TH) og kollagen type IV-antistoff, en etterfølgende to-timers inkubering med et sekundært antistoff var tilstrekkelig til å merke dopaminerge neuroner i en 500-um dybde (figur 3) . PRESTO-vev Immunolabeling Tette organer har generelt høye konsentrasjoner av ECM-fibre, som påvirker gjennomtrengning av antistoffer til vev. Dermed antistoffer Penetvurdert til en dybde på bare 20-30 um i tett vev, som for eksempel nyre vev, etter 12 timers inkubering. For å overvinne denne begrensningen, har vi designet aktive makromolekyl penetrasjon metoder som gjør levering av reagenser i dype vev, nemlig PRESTO (trykk relatert effektiv og stabil overføring av makromolekyler i de organer) (figur 4). Sammenlignet med statisk inkubasjon av ACT-behandlet nyrevevet med antistoff løsninger, bruk av sentrifugalkreftene (600 xg) med en table-top sentrifuge (sentrifugal PRESTO, c-PRESTO) sterkt forbedret antistoff levering i dype vev (figur 5). Når vi anvendt c-PRESTO fremgangsmåte for å tette vev, tre timers inkubering var tilstrekkelig til å merke 250- til 300-um dype strukturer. For å forbedre vev forvrengning uten vesentlig skade vev, vi også utviklet en maskin som gir konveksjon flyt med en sprøytepumpe (sprøyte PRESTO, s-PRESTO). Denne prosessen tilsvarende forbedret antistoff penetration sammenlignet med passiv diffusjon (Figur 5). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figur 1. Fremstilling av s-PRESTO apparat. A. En sprøyte (30 ml) og tre-veis stoppekran. B. De tre-veis stoppekran tilkoblet og limt til sprøyten. C. Den sprøyte som inneholder prøven og antistoff-løsning, og sprøyten plassert på sprøytepumpe. D. sprøytepumpe og arbeidsvilkår oppsett. E. Pumpen tilfører en oppløsning inneholdende merkings reagenser inn i prøven. Når det angitte volum er nådd, blir pumperetningen skifter og trekker oppløsningen etter en angitt tidsperiode. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Figur 2. ACT vev clearing av mus hjernen. A. Etter polymerisering, er gratis A4P0 løsninger ikke polymerisert; vev-tilført hydrogeler er gelated ved kryssbinding med endogene makromolekyler. B. 1- til 2 mm tykke hjerneskiver ble ryddet for 1 - 2 timer, og omfanget av ekspansjon og størrelse utvinning i reflekterende indeks (RI) -Matchende løsning ble registrert. C. Tykkelsen av hele musehjerne er omtrent 0,8 cm, og 5. - 6. h osv var tilstrekkelig til fullstendig klar hjernen. Etter 3 timer fra ETC, var det en betydelig mengde av ikke-klarert vev. Ved 6 timer med ETC, men tømming av hele hjernen hadde oppstått. Fargen på vev etter ACT i ETC buffer er hvit eller ugjennomsiktig. Ved RI justering, vev blir gjennomsiktig. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her</a>e for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figur 3. Immunolabeling med ACT-ryddet mus hjernevev. Bilder fra ACT-behandlet på 1 mm musehjernesnitt som viser mus hjerne cortex farget med et antistoff til kollagen type IV og en del av midthjernen farget med et antistoff til tyrosinhydroksylase (TH). Scale bar, 100 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figur 4. PRESTO immunolabeling metoder. Antistoffer kan ikke trenge inn i tette vev ved diffusjon. PRESTO immunolabeling metoder ble utviklet for å aktivt sette makromolekyler og å levere reagenser inntette vev. Anvendelsen av sentrifugalkreftene ved hjelp av en standard bordsentrifuge (sentrifugal PRESTO, c-PRESTO) markert tilrettelagt levering av antistoffer. Appling konveksjon flyt med en sprøytepumpe (sprøyte PRESTO, s-PRESTO) forbedret antistoff penetrasjon. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figur 5. PRESTO immunolabeling av ACT-ryddet tett vev. For c-PRESTO, ble vevene sentrifugert ved 600 x g i 3 timer ved bruk av en standard bordsentrifuge for å påskynde inntrengning av primære og sekundære antistoffer. For s-Presto, ble en sprøytepumpe brukes til å levere antistoffene. Mus organer, slik som nyrer og lever, ble merket med kollagen type IV. Sammenlignet med konvensjonelle metoder, 3 H avC- eller S-PRESTO markant forbedrer merking dybde. I nyrene og leveren, dybden av den Z-aksen strekker 300-350 um eller dypere i PRESTO prøver (til høyre), mens kontrollprøvene er merket i en dybde på bare 40 - 50 um (til venstre). En 3D rekonstruerte bildet ble oppnådd med en konfokalmikroskop. Scale bar, 100 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (aktiv klarhet teknikk trykk relaterte effektiv og stabil overføring av makromolekyler i organer) muliggjør rask, effektiv, men billig vev clearing og raske antistoff penetrasjon inn ryddet vev ved passiv diffusjon eller press-assistert levering. Ved hjelp av denne metoden, kan et bredt spekter av vev skal tømmes, immunolabeled av flere antistoffer, og volum avbildes.

ACT-PRESTO: biologisk vev Clearing og Immunolabeling Metoder for Volum Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volum segmentering og analyse av biologisk materiale med SuRVoS (super regionen volum segmentering) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Eggekstraktforberedelse og levende bildebehandlingsmetoder for visualisering av dynamisk cytoplasmatisk organisasjon

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk rydding av plantevev for fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...