Name: act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Эксперименты на животных должны соответствовать всем соответствующим государственным и институциональным правилам. 1. Приготовление реагентов <ol><li> Для гидрогель раствора мономера (A4P0): Добавить 20 г акриламида в 450 мл 0.1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и регулировать громкость до 500 мл PBS 0.1x. ВНИМАНИЕ: мономеры акриламида являются токсичными. Выполните все процедуры в вытяжном шкафу с средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто, перчатки и закрытую обувь. <ol><li> Непосредственно перед использованием добавляют 100 мг 2,2&#39;-азобис [2- (2-имидазолин-2-ил) пропан] дигидрохлорид к 40 мл раствора мономера гидрогель (A4P0) в 50 мл коническую пробирку под вытяжкой , </li></ol></li><li> Для клирингового электрофоретическая ткани (ETC) буфер: Добавьте 40 г додецилсульфата натрия (SDS) и 12,37 г борной кислоты в 800 мл деионизованной H 2 O (дН 2 O). Доводят рН до 8,5 с NaOH и регулировать громкость до1 л с дополнительным дН 2 O. ВНИМАНИЕ: SDS является вредным химическим; Таким образом, обращаться с ним осторожно. </li><li> Для КУБИЧНОЙ монтажа раствора: Добавить 250 г сахарозы, 125 г мочевины и 125 г N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-гидроксипропил) этилендиамин до 150 мл дН 2 O и довести объем до 500 мл с дН 2 O. </li></ol> 2. Подготовка образцов и фиксация <ol><li> Эвтаназия мыши. <ol><li> Подготовьте alfaxalone (1 мг / кг) и ксилазина (0,5 мг / кг) в одном шприце. </li><li> Внутрибрюшинно вводят смесь alfaxalone и ксилазином и позволяют 3 мин для мыши, чтобы стать в бессознательном состоянии. </li><li> Подождите, пока обезболены мыши больше не реагирует на болевые раздражители, такие как хвост крайнем случае, прежде чем продолжить. ВНИМАНИЕ: Следуйте соответствующие институциональные рекомендации по обращению с животными. </li></ol></li><li> Транскардиальную обрызгивать мышь со 100 мл 0,9% NaCl (рН 7,4-7,5), растворсодержащие гепарин (100 ед / мл) , чтобы обескровить, с последующим добавлением 100 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS (рН 7,4) 14. ВНИМАНИЕ: Решение PFA является токсичным. Приготовление раствора PFA и всей последующей обработки должны проводиться в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты. </li><li> Отрезать голову мыши, откройте кожу, и сломать череп между глазами, используя маленькие ножницы. </li><li> Удалить кусочки черепа с помощью маленьких, изогнутых щипцов. </li><li> Выньте мозг или желаемые органы. </li><li> Выдержите мозг и органы в пост-FIX 4% раствора PFA при 4 ° С в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки ткани конкретных-области, рассекают конкретного региона или обрезки ткани после фиксации ткани. ВНИМАНИЕ: Решение PFA является токсичным. Transcardial перфузия и все последующие обращения мыши должны проводиться в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты. </li></ol> 3. Гидрогель Мономер Настой и Полymerization <ol><li> Выдержите неподвижные органы в A4P0 растворе гидрогель мономера при температуре 4 ° С в течение 12-24 ч при осторожном встряхивании. </li><li> Гидрогель мономер-проникнуты полимеризации ткани. <ol><li> Передача образца до 10 мл с круглым дном трубки с 5 мл раствора мономера гидрогель. Заверните верх с круглым дном трубки с парафильмом. </li><li> Удалить кислород из круглым дном пробирку, содержащую гидрогель проникнуты весь образец мозга мыши при пропускании азота через жидкость в течение 1 мин. Быстро и плотно закрыть образец, содержащий трубку. </li></ol></li><li> Перенести трубку к водяной бане (37 &amp; deg; C) в течение 2 ч. </li><li> Промыть полимеризованный образец кратко с 0.1x PBS для удаления избытка гидрогель. ВНИМАНИЕ: гидрогеля мономеров являются токсичными. Для того, чтобы избежать контакта кожи с гидрогеля мономера, выполнять все процедуры в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто и перчатки. Примечание: полимеризованной тканимогут быть сохранены в PBS, содержащем 0,1 x азида натрия в течение более 2-х недель при температуре 4 ° С. ВНИМАНИЕ: азид натрия сильно и остро токсичен. Выполните все процедуры в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто и перчатки. </li></ol> 4. Электрофорезная ткани Клиринг (ETC) <ol><li> Передача полимеризованный образца в контейнер ткани и поместите контейнер ткани в ETC камере. </li><li> Заполните ETC ETC камера с использованием буфера peristatic насоса. </li><li> Установите условия и т.д., и запустить Т.Д. Используйте следующие параметры. <ol><li> Для настройки и т.д. для целых органов, используйте следующие настройки: (1,5 ампер), температура (37 ° C), время работы (6,0 ч), скорость работы насоса (30 оборотов в минуту). </li><li> Для настройки и т.д. для толстых срезов мозга мыши от 1 до 2 мм, используйте следующие параметры: ток (1,5 ампер), температура (37 ° C), время работы (2,0 ч), скорость работы насоса (30 оборотов в минуту). </li></ol></li><li> Перенос тон очистил образец в коническую пробирку объемом 50 мл с 45 мл PBS 0.1x. Промыть очищенные образцы несколько раз с помощью PBS 0.1x, пока не было пузырей видны, когда трубка на короткое время встряхивают (чтобы подтвердить полное удаление SDS). </li></ol> 5. иммунноокрашивания Закона обработанных тканей <ol><li> Для мыши весь мозг: Инкубируйте образца в объеме 3-мл раствора антитела, содержащего 1X PBS, 6% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,1% Тритон Х-100, и 0,01% азида натрия (антитело раствора разбавления) с разбавлением фактор 1/500 для тирозин гидроксилазы (TH) антитела в течение 4 дней при температуре 37 ° C при умеренном встряхивании. Заменить раствор антитела в конце 2-й день. <ol><li> Отмывки образца в конической трубе 50 мл с 45 мл PBS 0.1x в течение 3 - 5 ч и изменить буфер через каждый час. </li><li> Инкубируйте образца в объеме 3-мл разведений антител раствора с коэффициентом разбавления 1/500 для осла против кроличьего 488 вторичного антитела в течение 4 дней при температуре 37 ° C при умеренном встряхивании. Replасе разбавленные антитела решения на 2-й день. </li></ol></li><li> Для получения 1 до толстой ткани мозга нарезанные 2 мм: Выдержите образец на ночь или на срок до 1 суток в 0,5- до 1-мл объема разбавления раствора антитела с коэффициентом разбавления 1/500 для IV антитела коллагена типа на 37 ° C с мягким встряхиванием. <ol><li> Отмывки образца в конической трубе 15-мл с объемом 12 мл 0.1x PBS в течение 1-2 ч. Изменение буферу каждый час. </li><li> Инкубируйте образца в 0,5- до 1-мл объеме разведений антител раствора с коэффициентом разбавления 1/500 для Cy-3 конъюгированные анти-кроличий вторичное антитело на ночь или на срок до 1 суток при температуре 37 ° С с мягким встряхиванием. </li></ol></li><li> Промыть образец в 0.1x PBS в течение 3 - 5 ч; изменить буферу каждый час. </li><li> До начала обработки изображений, инкубировать образец в соответствующем количестве кубического монтирования раствора в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Заменить свежей кубического крепление раствора и инкубируют в течение еще 1 ч. ЗАМЕТКА: </b&gt; 76 тип антител хорошо работал в мышиных ACT обработанные ткани, в том числе 31 моноклональных антител 14. Предварительно меченных ткани могут быть скомбинированы с иммунноокрашивания еще двух флюорохромами в АКТ-обработанной ткани. </li></ol> 6. иммунноокрашивания плотных тканей (Presto) <ol><li> с-PRESTO Примечание: C-PRESTO подходит для малогабаритных образцов, таких как весь семенника, всей почки или небольших участков крупных органов. <ol><li> Переноса образца в пробирку 1,5 мл, добавляют 500 мкл раствора антитела разбавления коэффициент разбавления 1/500 для коллагена типа IV антитела, и центрифугировать пробирку при 600 х г в течение 2 ч. </li><li> Промыть окрашенного образца с 0.1x PBS путем центрифугирования при 600 × г в течение 30 мин. </li><li> Добавьте 500 мкл раствора антитела разбавления коэффициент разбавления 1/500 для Cy-3 конъюгированных с антителом против кроличьего вторичным антителом и центрифуге при 600 × г в течение 2 ч. </li><li> Вымойте окрашивали образец с 0.1X PBS путем центрифугирования при 600 × г в течение 30 мин. </li></ol></li><li> s-PRESTO Примечание: s-PRESTO подходит для больших тканей. <ol><li> Подготовьте шприц (30 мл объема) и подключить его к 3-ходового клапана (рисунок 1А). Клей клапан с клеевой пистолет для условий высокого давления (рис 1В). </li><li> Передача образца в 3-х ходового клапана подключенного шприца в положении закрытого клапана. </li><li> Добавьте 5 - 7 мл раствора антител разбавление коэффициент разбавления 1/500 для IV антител коллагена типа. Выпуск раствора антител в образце путем открытия клапана. </li><li> Установите поршень шприца в положение 17-мл, чтобы обеспечить достаточное пространство для движения инфузии / вывода. Это может быть сделано в положении открытого клапана. Закройте 3-ходовой клапан после того, как установка шприца закончена. </li><li> Поместите шприц, содержащий образец на шприцевой насос. Установите условия шприцевой насос с объемом инфузии / вывода 10 мл / мин и 4-мин время паузы на режиме непрерывного цикла (рис 1C). ПРИМЕЧАНИЕ: Насос вливает , пока он не достигнет целевого объема (10 мл), а затем направление потока изменяется после короткой паузы (4 мин). </li><li> Запустить шприцевой насос в течение 3 - 24 ч при комнатной температуре (рис 1F). </li><li> Откройте 3-ходовой клапан и заменить раствор с 0.1x PBS. </li><li> Промыть образец окрашивали дважды 0.1x PBS в течение 1 часа каждый раз, используя шприцевой насос. </li><li> Изменение с разведения антитела раствором, содержащим Cy-3 сопряженную анти-кроличьего вторичное антитело (разведение фактор 1/500) и запустить шприцевой насос в течение 3 - 24 ч. </li><li> Откройте 3-ходовой клапан и заменить раствор с 0.1x PBS. </li></ol></li><li> До начала обработки изображений, инкубировать образец окрашивали в соответствующем количестве кубического-крепление раствора в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Заменить свежей кубического крепление раствора и инкубируют в течение еще 1 ч. </li></ol> 7. Яmaging <ol><li> Поместите помеченную ткани в конфокальной блюдо и добавить кубического монтирования решение, пока ткань не покроется. Поместите покровное на ткани. С помощью конфокальной микроскопии для получения изображения ткани 14 под цели 10X. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Плохая фиксация или гидрогель погружения в ткани может привести к потере белков и искажение ткани в процессе клирингового ткани. Весь мозг взрослого мышь следует инкубировать в 4% параформальдегид в течение ночи, с последующим погружением в минимальном объеме 20 мл гидрогеля раствора мономера в течение 12 - 18 ч при осторожном встряхивании. Для больших тканей, включая ткани человека, таких как срезах мозга и спинного мозга, расширенные выдержки времени в растворе гидрогеля мономера требуется. Протокол ACT легко применим к очистке основных тканей, поскольку фиксации ткани и полимера инфузионные стадии разделены. После очистки ткани, ткани человека были хорошо окрашивают несколько антител. Обратите внимание, что техника АКТ клиринг не совместим с алкоголем фиксаторами, такими как этанол и метанол. Стадию полимеризации ткани гидрогель также имеет важное значение для получения хорошего качества ткани после процесса клиринга. Потому каккислород ингибирует полимеризацию акриламида, она должна быть удалена дегазацией тканевого раствора, содержащего в соответствии с системой газообразного азота инфузии. В качестве альтернативы, де-оксигенации может быть выполнена с использованием вакуумной камеры с блоком тепла в течение 23 часов. Скорость посредничества зависит от целого ряда факторов, включая размер органа, содержание липидов или ECM - волокнистых белков, состояние фиксации и т.д. Большинство тканей взрослых мышей может быть очищен ETC в течение ночи. Тем не менее, существует риск ненужных чрезмерной очистки и отеком тканей; Таким образом, различия во времени клирингового имеют важное рассмотрение. Tissue-клиринговые условия должны быть определены эмпирически. Важно отметить, что содержание ECM может влиять на внешний вид очищенную ткани. Цвет ткани остается белым или непрозрачными, даже после того, ACT в ETC буфере, поскольку ACT не очищает плотных белковых волокон. Тем не менее, когда эти органы были погружены в раствор согласующего RI, тоу стала прозрачной. Скорость набухания ткани по-видимому, зависит от содержания РЭБ тканей и мягких органов, таких как мозг, обнаруживают большее отношение к набуханию, чем плотных органов. Поскольку увеличился отек тканей поможет процедура тканевого клиринговую, ACT обычно перегоняют утилизирует буфер на водной основе в большинстве случаев. В некоторых случаях, когда опухоль ткани или транзиторную уродства не желательно, например, в эмбрионах, буфер, содержащий 0,1 x PBS, может быть применен для изображений с высоким разрешением. Следует также отметить, что более высокие концентрации соли в буфере может привести к усадке тканей. Метод ACT может прояснить целые органы и даже всего тела мыши 14. Тем не менее, глубокие ткани визуализации прозрачной ткани требует специальных микроскопов и задач. Таким образом, ткань мозга от 1 до 2 мм толщиной является наиболее эффективным для визуализации с обычным конфокальной микроскопии. В наших руках, удаление этикеткиEd антитела от ACT обработанных тканей антитело-зависимой, и патронов различного маркировки антител не рекомендуется. Было получено несколько антител, такие как TH и GFAP, работали особенно хорошо для всего головного мозга иммунноокрашивания 14. С другой стороны, некоторые антитела, такие как Tuj1 или map2, часто маркируются только поверхность тканей. Это может быть улучшено с помощью других методов, таких как переключатель 15. Другим потенциальным ограничением является то, что это может быть трудно сохранить мелкие белковые структуры в ACT обработанные ткани из-за ткани отеки и усадки во время стадии тканевого очистив. Методика PRESTO применима к широкому разнообразию методов тканевой маркировки. Например, в ткани-прозрачных методов с использованием предварительно меченных ткани, такие как SeeDB 4 и iDISCO 7, иммуномечение из плотной ткани требует периоды инкубации дольше , чем несколько дней до нескольких недель. Тем не менее, ПРЕСТО может сократить время инкубации до нескольких часов, еnabling завершение всего процесса в течение дня с 1-мм толщиной плотной ткани. PRESTO может повысить эффективность глубокой маркировки толстой, плотной ткани, или даже не-расчищенных толстых тканей. Поскольку PRESTO использует настольный центрифуге или шприцевой насос и не требует какого-либо специального оборудования, то относительно легко реализовать эту технику с рутинными процедурами лаборатории.

Одна из проблем в нейробиологии является визуализация нейронной разводки цепей и отдельных клеток в неповрежденной ткани мозга. До недавнего времени, демонстрируя связи между нейронами, таким образом, не требуется 1) последовательный секционирования тканей; 2) молекулярная маркировка конкретных целей, таких как аксонов или белки; и 3) визуализация с помощью 3D реконструкции всего мозга с помощью вычислительной регистрации или выравнивания 2D последовательных изображений 1. Эти шаги являются трудоемкими, требуют много времени, и несут ответственность потерять информацию во время секционирования и маркировки, что делает нейронная сеть отображение чрезвычайно трудно. Тем не менее, многие методы, которые позволяют для визуализации неповрежденной ткани без секционирования были разработаны. Биологические ткани могут быть сделаны оптически прозрачной тканью очищающих методов 2-10. Одним из основных методов является уменьшение рефракционных различия преломления между здоровой тканью и раствором погружением в порядкечтобы уменьшить рассеяние света в неповрежденной ткани, таким образом делая ткань прозрачной и позволяет наблюдать глубинных структур. Некоторые виды погружных растворов имеют гидрофобные свойства, что приводит к быстрому флуоресцентной тушению во время процедуры обезвоживания. Таким образом, эти методы не совместимы с флуоресцентной визуализации в течение длительного периода времени 11,12. Вместо гидрофобных реагентов, другие способы используют гидрофильные реагенты для очистки ткани, такие как SeeDB 4 и ЗОБ л е 6, которые поддерживают структурную информацию и флуоресценции 4,6,8 биологической ткани. Тем не менее, макромолекулы, в том числе антител, могут не достичь ядро ​​неповрежденной ткани путем диффузии в одиночку. Таким образом, предварительно маркирование молекул-мишеней в глубоких областях плотно упакованных тканей является технически сложной задачей. В недавно разработанный метод тканевой клирингового, CLARITY 3, гидрогель встраиваемый я биологическая тканьы сформированы с акриламидом, и липиды удаляются с помощью электрофореза в соответствии с додецилсульфатом натрия (SDS) -содержащего раствором. Затем образец погружают в раствор с отражающим совпадающего индекса для уменьшения рассеяния света 3. Система удаления липидов был позже изменен в расширенном CLARITY 13 и ПАКТ (пассивной техники ясности) 10. После полимеризации акриламида цепи сшиваются с белками, образуя гидрогель ткани. липидные компоненты не могут с акриламидом увязать экологические; Таким образом, липиды могут быть устранены с помощью электрофореза в соответствии с ДСН-содержащим буфером. Благодаря активному элиминации липидов, ткани головного мозга заметно повышает прозрачность 9. Однако эти методы не учитывают невозможность глубокой маркировки путем свободной диффузии. Чтобы преодолеть это ограничение, методы активного транспорта реагентов в глубоких частях толстых тканей требуется. Хотя ЯСНОСТЬ позволяет очистку ткани и глубокие тканивизуализация, это не легкая или быстрая процедура. Это может занять несколько недель , чтобы очистить целую 7,14 мозга мыши. Быстрая очистка тканей имеет важное значение для применения таких методов к основным или клинических лабораторных условиях для исследования наук о жизни или диагностики томов. Текущий протокол обеспечивает упрощенный процесс оформления биологической ткани и последующего обнаружения белка по давлению родовспоможение иммуно-окрашивания. Она подходит для высокого разрешения объемной визуализации больших и 3D поданной систем обработки данных с помощью комбинации с методами визуализации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Выявление и изучение детальной организации органов или всего организма на клеточном уровне фундаментальные проблемы в биологии. Переходные методы требуют значительного количества времени и усилий, чтобы получить 3D-изображение и в том числе секционирования неповрежденной ткани, иммунноокрашивания и визуализации серийно секционного ткани, которая производит потерю информации на каждом этапе процесса. В недавно разработанных подходов для изображений с высоким разрешением в неповрежденной ткани, молекулярная характеристика была ограничена мечения белков. Тем не менее, имеющиеся в настоящее время протоколы для очистки органов требуют значительно долгое время процесса, что делает его трудно реализовать методы клиринговых ткани в лаборатории. Недавно мы установили быстрое и высоко воспроизводимым протокол называется ACT-PRESTO (а ctive с сивное т echnique- р ия г приподнятое е fficient и s у таблицы ransferмакромолекул в о rgans), что позволяет клиренса ткани в течение нескольких часов. Кроме того, ACT-PRESTO позволяет быстро иммунноокрашивания с традиционными методами и ускоряет проникновение антител в глубокий слой плотно сформированным, толстых образцов путем применения давления или конвекционного потока. Мы опишем, как подготовить ткани, как очистить путем удаления липидов с помощью электрофореза, и как иммуно-окрасить с помощью доставки при надавливании помощь. Быстрота и согласованность протокола позволит ускорить производительность 3D гистологического исследования и диагностики на основе объема.

Клиринг ACT-ткани Одним из важных факторов, влияющих на клиринг ткань фиксации ткани. PFA фиксации и акриламид вливание отдельные шаги в этом протоколе. После того, как на стадии полимеризации ткани-гидрогель, свободное решение A4P0 не полимеризуется, хотя ткань вселенным гидрогели сшивают с эндогенными макромолекулами. Таким образом, гель не должен образовывать вне тканей (фиг.2А). Эта процедура приводит к меньшему количеству АКТ сшивок между белками и акриламид по сравнению с протоколом четкостью. Соответственно, ткань-гидрогелевые образец имеет более пористую структуру. Эта функция позволяет быстро экстракции липидов и диффузии макромолекул. Срезы головного мозга мыши от 1 , до 2 мм толщиной были достаточно очищены в течение 1 - 2 ч (Фигура 2В), и 5 - 6 ч внеземных было достаточно для Clearance целых мозга мыши (рис 2С). Гидрогель-опосредованной клиринг ткани индуцируется расширение ткани после стадии ETC, но ткань возвращается к исходному размеру в отражательной индексу соответствует решению. Ткань-гидрогелевые образца формируется в процедуре ACT сильно пористым, и , таким образом, небольшие соединения и макромолекулы могли проникнуть эффективно и легко диффундируют (рисунок 3). После 2-часовой инкубации срезов головного мозга 1-мм с тирозин - гидроксилазы (TH) и коллагена типа IV антитела, последующее 2-часовой инкубации с вторичным антителом , было достаточно , чтобы маркировать дофаминергических нейронов на глубине 500 мкм (рис 3) , Иммунноокрашивания PRESTO тканей Плотные органы обычно имеют высокую концентрацию ECM волокон, что влияет на проникновение антител в ткани. Таким образом, антитела penetрассчитаны на глубину всего 20-30 мкм в плотных тканей, таких как ткани почек, после 12 ч инкубации. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали активные методы проникновения макромолекулы , которые позволяют доставку реагентов в глубоких тканях, а именно PRESTO (давление , связанные с эффективной и стабильной передачи макромолекул в органы) (Рисунок 4). По сравнению со статической инкубации ACT обработанных почечной ткани с растворами антител, применение центробежных сил (600 XG) с настольной центрифуге (центробежная PRESTO, с-PRESTO) значительно улучшили доставку антител в глубокие ткани (рисунок 5). Когда мы применили процедуру с-PRESTO для плотных тканей, 3 ч инкубации было достаточно, чтобы обозначить 250- до 300 мкм глубоких структур. Для того, чтобы улучшить искажение ткани без значительного повреждения ткани, мы также разработали машину, которая обеспечивает конвекционный поток с помощью шприца (шприц PRESTO, втор-Presto). Этот процесс аналогичным образом улучшен ре антителnetration по сравнению с пассивной диффузии (рисунок 5). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Рисунок 1. Получение s-PRESTO аппарата. А. шприц (30 мл) и трехходовой кран. B. Трехходовой кран соединен и приклеены к шприцу. С. шприц , содержащий образец , и антитело раствор, а шприц помещают на шприцевой насос. Д. шприцевой насос и работа установки состояние. Е. Насос вливается раствор , содержащий маркировочные реагентов в образец. Когда назначенный объем достигается насосную изменения направления и отзывает решение по истечении определенного периода времени. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 2. АКТ ткани очистка мозга мыши. A. После полимеризации свободные растворы A4P0 не полимеризуется; тканевые проникнуты гидрогели гелеобразного сшиванием с эндогенными макромолекул. Б. 1- до толстых срезах мозга 2-мм были очищены в течение 1 - 2 ч, а степень расширения и восстановления размеров в отражательной индекса (RI) Сопоставления решение было зарегистрировано. С. Толщина всего головного мозга мыши составляет около 0,8 см, а 5 - 6 ч ETC было достаточно , чтобы полностью очистить мозг. Через 3 часа ЕТС, наблюдалось значительное количество не очищается ткани. К 6 ч ETC, тем не менее, имели место очистка всего головного мозга. Цвет тканей после ACT в буфере ETC белый или непрозрачными. Путем регулировки RI, ткани становятся прозрачными. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">нажмите ее</a>е, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Рисунок 3. иммунноокрашивания с ACT-очистили ткани мозга мыши. Изображения ACT обработанным 1 мм срезах мозга мыши, показывая кортекс мозга мыши окрашивали антителами к коллагена типа IV и часть среднего мозга, окрашенном с антителом к ​​Тирозингидроксилаза (TH). Масштаб бар, 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Рисунок 4. Методы иммунноокрашивания PRESTO. Антитела не могут проникать в плотные ткани путем диффузии. Методы PRESTO иммунноокрашивания были разработаны, чтобы активно вливать макромолекулы и поставлять реагенты вплотные ткани. Применение центробежных сил с использованием стандартной настольной центрифуге (центробежная PRESTO, с-Presto) заметно облегчило доставку антител. Аплинг конвекционного потока с помощью шприца (шприц PRESTO, s-Presto) улучшенного проникновения антител. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Рисунок 5. PRESTO иммунноокрашивания из ACT-очищается плотной ткани. Для C-PRESTO, ткани центрифугировали при 600 мкг в течение 3 ч с использованием стандартной настольной центрифуге для того, чтобы ускорить проникновение первичных и вторичных антител. Для S-PRESTO, шприц насос использовался для доставки антител. Органы мыши, такие как почки и печень, метили коллагена типа IV. По сравнению с традиционными методами, 3 чc- или s-PRESTO заметно увеличивает глубину маркировки. В почках и печени, глубина Z-оси достигает 300 - 350 мкм или глубже в образцах PRESTO (справа), в то время как контрольные образцы помечены на глубине всего 40 - 50 мкм (слева). 3D-восстановленное изображение было получено с помощью конфокальной микроскопии. Масштаб бар, 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (активная ясность метод давления, связанных с эффективной и стабильной передачи макромолекул в органы) обеспечивает быстрое, эффективное, но недорогой клиринг ткани и быстрое проникновение антител в расчищенных ткани путем пассивной диффузии или давлению родовспоможение. Используя этот метод, широкий спектр тканей может быть очищен, immunolabeled несколькими антителами, а объем-образа.

ACT-PRESTO: Биологическая ткань Очистка и иммунноокрашивания Методы визуализации Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Методы изучения данио рерио Верхнечелюстная Барбель

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Синтез и калибровка Фосфоресцирующая нанозонды для кислорода изображений в биологических системах

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Объем сегментации и анализ биологических материалов с помощью Workbench SuRVoS (супер-регионе объем сегментация)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Подготовка экстракта яйцеклеток и методы визуализации в реальном времени для визуализации динамической цитоплазматической организации

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) образцов биологических тканей

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Оптическая очистка тканей растений для флуоресцентной визуализации

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...