Name: act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Djurförsök måste överensstämma med alla relevanta statliga och institutionella regler. 1. Beredning av reagenser <ol><li> För hydrogel monomerlösningen (A4P0): Tillsätt 20 g av akrylamid till 450 ml 0,1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och justera volymen till 500 ml med 0,1 x PBS. VARNING: Akrylamid monomerer är giftiga. Utför alla förfaranden i ett dragskåp med personlig skyddsutrustning, inklusive ansiktsskydd, laboratorierock, handskar och slutna tå skor. <ol><li> Omedelbart före användning, tillsätt 100 mg 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propån] dihydroklorid till 40 ml hydrogel monomerlösning (A4P0) i en 50 ml koniska rör under en huv . </li></ol></li><li> För den elektroforetiska vävnads clearing (ETC) buffert: Lägg 40 g natriumdodecylsulfat (SDS) och 12,37 g borsyra till 800 ml avjoniserat H2O (dH 2 O). Justera pH till 8,5 med NaOH och justera volymen till1 L med ytterligare dH2O VARNING: SDS är en skadlig kemikalie; Därför hantera den med omsorg. </li><li> För CUBIC-mount Lösning: Tillsätt 250 g sackaros, 125 g urea, och 125 g N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-hydroxipropyl) etylendiamin till 150 ml dH 2 O och ta volymen till 500 ml med dH 2 O. </li></ol> 2. Provberedning &amp; Fixering <ol><li> Eutanasi på musen. <ol><li> Förbered alfaxalon (1 mg / kg) och xylazin (0,5 mg / kg) i samma spruta. </li><li> Intraperitonealt injicera blandning av alfaxalon och xylazin och låt 3 min för musen för att bli medvetslös. </li><li> Vänta tills sövda musen inte längre svarar på smärtsamma stimuli, såsom en svans nypa, innan du fortsätter. VARNING: Följ lämpliga institutionella riktlinjer för hantering av djur. </li></ol></li><li> Transkardiellt BEGJUTA musen med 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4 till 7,5) lösninginnehållande heparin (100 U / ml) för att exsanguinate, följt av 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4) 14. VARNING: PFA lösning är giftig. Beredningen av PFA lösning och alla efterföljande hantering måste utföras i ett dragskåp och med personlig skyddsutrustning. </li><li> Skär av musen huvudet, öppna upp huden och bryta skallen mellan ögonen med en liten sax. </li><li> Ta bort delar av skallen med små, böjda pincett. </li><li> Ta ut hjärnan eller önskade organ. </li><li> Inkubera hjärnan och organ i post-fix 4% PFA-lösning vid 4 ° C över natten. OBS: För specifik region vävnads clearing, dissekera den specifika regionen eller trimma vävnad efter vävnadsfixering. VARNING: PFA lösning är giftig. Den transcardial perfusion och alla efterföljande hantering mus måste utföras i ett dragskåp och med personlig skyddsutrustning. </li></ol> 3. Hydrogel Monomer Infusion och Polymerization <ol><li> Inkubera fasta organ i A4P0 hydrogel monomerlösning vid 4 ° C under 12-24 h med försiktig skakning. </li><li> Hydrogel monomer-infunderas vävnad polymerisation. <ol><li> Överföra provet till en 10 ml rundbottnad rör med 5 ml hydrogel monomerlösning. Linda toppen av rundbottnad rör med Parafilm. </li><li> Ta bort syre från rundbottnad röret med hydrogel-sista hela mushjärna prov genom att bubbla kväve genom vätskan under 1 minut. Snabbt och tätt stänga provinnehållande rör. </li></ol></li><li> Överföra röret till ett vattenbad (37 ° C) under 2 timmar. </li><li> Tvätta polymeriserade provet kort med 0,1 x PBS för att avlägsna överskott hydrogel. VARNING: Hydrogel monomerer är giftiga. För att undvika hudkontakt med hydrogel monomer, utföra alla procedurer i ett dragskåp och med personlig skyddsutrustning, inklusive ansiktsskydd, laboratorierock och handskar. NOT: Polymeriserad vävnaderkan lagras i 0,1 x PBS innehållande natriumazid för mer än 2 veckor vid 4 ° C. VARNING: Natriumazid är mycket och akut giftig. Utför alla förfaranden i ett dragskåp och med personlig skyddsutrustning, inklusive ansiktsskydd, laboratorierock och handskar. </li></ol> 4. Elektro Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Överför polymeriserade provet till ett vävnadsbehållare och placera vävnaden behållaren i ETC kammaren. </li><li> Fyll ETC kammaren med ETC buffert med hjälp av peristatic pump. </li><li> Ställ in ETC förhållanden och kör ETC. Använd följande inställningar. <ol><li> För ETC inställningar för hela organ, använd följande inställningar: (1,5 amp), temperatur (37 ° C), gångtid (6,0 h), pumphastigheten (30 varv per minut). </li><li> För ETC inställningar för 1- till 2 mm tjocka mus hjärnan skivor, använd följande inställningar: ström (1,5 ampere), temperatur (37 ° C), gångtid (2,0 h), pumphastigheten (30 varv per minut). </li></ol></li><li> överförings tHan röjde provet till en 50-ml koniska rör med 45 ml av 0,1 x PBS. Tvätta rensas prov flera gånger med 0,1 x PBS tills inga bubblor ses när röret kortvarigt skakas (för att bekräfta fullständigt avlägsnande av SDS). </li></ol> 5. immunomärkning av ACT-behandlade vävnader <ol><li> För mus hela hjärnan: Inkubera provet i en 3-ml volym av antikroppslösning innehållande 1 x PBS, 6% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100, och 0,01% natriumazid (antikroppsspädlösning) med en spädning faktor på 1/500 för tyrosinhydroxylas (TH) antikropp under 4 dagar vid 37 ° C med mild skakning. Ersätta antikropplösningen vid slutet av dag 2. <ol><li> Tvätta provet i en 50 ml koniska rör med 45 ml 0,1 x PBS för 3 - 5 timmar och ändra bufferten varje timme. </li><li> Inkubera provet i en 3-ml volym av utspädningsantikroppslösning med en utspädningsfaktor på 1/500 för åsne-anti-kanin 488 sekundär antikropp under 4 dagar vid 37 ° C med mild skakning. repless de utspädda antikropps lösningar på dag två. </li></ol></li><li> För 1- till 2 mm tjockt skivade hjärnvävnad: Inkubera provet över natten eller upp till en dag i en 0,5- till 1 ml volym av spädantikroppslösning med en utspädningsfaktor på 1/500 för kollagen typ IV antikropp vid 37 ° C med mild skakning. <ol><li> Tvätta provet i en 15 ml koniska rör med en 12 ml volym av 0,1 x PBS i 1-2 timmar. Ändra bufferten varje timme. </li><li> Inkubera provet i en 0,5- till 1 ml volym av spädantikroppslösning med en utspädningsfaktor på 1/500 för Cy3-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp över natten eller upp till en dag vid 37 ° C med mild skakning. </li></ol></li><li> Tvätta provet i 0,1 x PBS för 3-5 h; ändra bufferten varje timme. </li><li> Före avbildning, inkubera provet i en lämplig mängd av CUBIC-mount lösning under 1 h vid rumstemperatur med försiktig skakning. Ersätta med färsk CUBIC-mount-lösning och inkubera under ytterligare 1 h. NOTERA: </b&gt; 76 typ av antikroppar fungerade bra i mus ACT-behandlade vävnaden, inklusive 31 monoklonala antikroppar 14. Pre-märkt vävnad kan kombineras med den immunmärkningen av ytterligare två fluorokromer i ACT-bearbetad vävnad. </li></ol> 6. immunomärkning av täta vävnader (Presto) <ol><li> c-PRESTO OBS: c-PRESTO är lämplig för små stora prover, såsom hel testikel, hel njure, eller små delar av större organ. <ol><li> Överföra provet i en 1,5-ml rör, tillsätt 500 mikroliter av antikroppsutspädningslösningen med en utspädningsfaktor på 1/500 för kollagen av typ IV-antikropp, och centrifugera röret vid 600 x g under 2 h. </li><li> Tvätta det färgade provet med 0,1 x PBS genom centrifugering vid 600 x g under 30 min. </li><li> Tillsätt 500 mikroliter av antikroppsutspädningslösning med en utspädningsfaktor på 1/500 för Cy3-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp och centrifugera vid 600 x g under 2 h. </li><li> Tvätta färgade provet med 0.1x PBS genom centrifugering vid 600 x g under 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO OBS! S-PRESTO är lämplig för större vävnader. <ol><li> Förbered en spruta (30 ml volym) och ansluta den till en 3-vägsventil (Figur 1A). Limma ventilen med en limpistol för högtrycksförhållanden (Figur 1B). </li><li> Överföra provet i ventilen kopplade sprutan 3-vägs i det stängda-ventilens läge. </li><li> Tillsätt 5 - 7 ml antikroppsspädning med en utspädningsfaktor på 1/500 för kollagen typ IV antikropp. Frigöra antikroppslösningen in i provet genom att öppna ventilen. </li><li> Ställa in sprutkolven till 17-ml position för att ge tillräckligt med utrymme för infusion / uttagsrörelsen. Detta kan göras i den öppna ventilläget. Stänger 3-vägsventilen efter inställningen sprutan är klar. </li><li> Sätt sprutan innehåller provet på en sprutpump. Fastställa villkoren sprutpump till en infusions / uttagsvolym på 10 ml / min och en 4-min paustid på kontinuerlig cykel läge (Figur 1C). OBS: Pumpen ingjuter tills den når målvolymen (10 ml), och sedan flödesriktningen ändras efter en kort paus (4 min). </li><li> Köra sprutpumpen under 3 - 24 h vid rumstemperatur (figur 1F). </li><li> Öppna 3-vägsventilen och ersätta lösning med 0,1 x PBS. </li><li> Tvätta färgade provet två gånger med 0,1 x PBS under 1 timme varje gång med sprutpumpen. </li><li> Byt med spädantikroppslösning innehållande Cy3-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp (spädningsfaktor av 1/500) och kör sprutpumpen 3 - 24 timmar. </li><li> Öppna 3-vägsventilen och ersätta lösning med 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Före avbildning, inkubera det färgade provet i en lämplig mängd av CUBIC-mount lösning under 1 h vid rumstemperatur med försiktig skakning. Ersätta med färsk CUBIC-mount-lösning och inkubera under ytterligare 1 h. </li></ol> 7. jagmaging <ol><li> Placera den märkta vävnad i ett konfokalt skål och tillsätt CUBIC-mount lösning tills vävnaden är täckt. Placera en täck på vävnaden. Använd ett konfokalmikroskop att avbilda vävnaden 14 under 10X objektivet. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Dålig fixering eller hydrogel nedsänkning i vävnader kan orsaka förlust av proteiner och en snedvridning av vävnad under vävnadsclearingprocessen. Hela den vuxna musen hjärnan bör inkuberas i 4% paraformaldehyd över natten, följt av nedsänkning i en minimivolym av 20 ml hydrogel monomerlösningen under 12 - 18 h under försiktig skakning. För stora vävnader, innefattande human vävnad såsom hjärnan skivor och ryggmärg, förlängd blötläggning tid i hydrogelen monomerlösningen krävs. ACT-protokollet är lätt tillämpas på clearing av fasta vävnader, eftersom vävnadsfixering och polymerinfusionssteg separeras. Efter vävnads clearing mänskliga vävnader var väl färgades med flera antikroppar. Notera att ACT clearing teknik är inte kompatibel med alkohol fixativ, såsom etanol och metanol. Vävnaden-hydrogel polymerisationssteget är också avgörande för att producera bra kvalitet vävnad efter clearingprocessen. Därför attsyre inhiberar polymerisationen av akrylamid, bör de avlägsnas genom avgasning av vävnadsinnehållande lösningen under en kvävgasinfusionssystem. Alternativt kan de-syresättning exekveras med hjälp av en vakuumkammare med ett värmeblock under 23 timmar. Clearinghastigheten är beroende av flera faktorer, bland annat organstorlek, innehåll av lipider eller ECM fibrösa proteiner, skick fixering, etc. De flesta vuxna musvävnader kan tömmas genom ETC natten. Det finns dock en risk för onödig över clearing och vävnadssvullnad; således skillnaderna i clearing tid är av viktig faktor. Vävnadsclearing villkor bör bestämmas empiriskt. Viktigare, kan innehållet i ECM påverka utseendet på den rensade vävnaden. Färgen på vävnaderna förblir vita eller opaka, även efter det att ACT i ETC buffert, eftersom lagen inte klara täta proteinfibrer. Men när dessa organ sänktes ned i RI matchande lösning, deny blev transparent. Hastigheten för vävnadssvullnad förefaller vara beroende av de ECM innehållet i vävnaderna, och mjuka organ, såsom hjärnan, att uppvisa en större svällningsförhållande än täta organ. Eftersom ökad vävnad svullnad kommer att hjälpa vävnadsclearingförfarandet, ACT rutinmässigt utnyttjar destillerat vatten baserade buffert i de flesta fall. I vissa fall, när vävnad svullnad eller övergående missbildning är inte önskvärt, såsom i embryon, buffert innehållande 0,1 x PBS kan sökas med hög upplösning. Det bör också noteras att högre saltkoncentrationer i bufferten skulle kunna orsaka krympning av vävnader. ACT-metoden kan klargöra hela organ och till och med hela kroppen av en mus 14. Men djupt vävnad avbildning av transparent vävnad kräver speciella mikroskop och mål. Således är hjärnvävnad 1 till 2 mm tjock mest effektiva för avbildning med en konventionell konfokalmikroskop. I våra händer, avlägsnande av etikettened antikroppar från ACT-behandlade vävnader är antikroppsberoende, och rundor av olika antikroppsmärkning rekommenderas inte. Flera antikroppar, såsom TH och GFAP, fungerat särskilt bra för hela hjärnan immunmärkning 14. Å andra sidan har vissa antikroppar, såsom Tuj1 eller MAP2, ofta märkta endast ytan av vävnaderna. Detta kan förbättras genom andra metoder, såsom SWITCH 15. En annan potentiell begränsning är att det kan vara svårt att bevara fina proteinstrukturer i ACT-bearbetad vävnad på grund av vävnaden svullnad och krympning under den vävnadsclearingsteget. Presto teknik kan tillämpas på en mängd olika vävnadsmärkningstekniker. Till exempel i vävnadstransparenta metoder med hjälp av pre-märkta vävnad, såsom SeeDB 4 och iDISCO 7, immunmärkningen av tät vävnad kräver inkubationsperioder längre än några dagar till veckor. Emellertid kan PRESTO förkorta inkubationstiden till flera timmar, enabling fullbordandet av hela processen inom en dag med en-mm tjock tät vävnad. PRESTO kan förstärka effekten av djup märkning tjocka, täta vävnader, eller till och med un-rensas tjocka vävnader. Eftersom PRESTO använder en bordscentrifug eller sprutpump och kräver ingen speciell utrustning, är det relativt enkelt att implementera denna teknik med rutinlaboratorieförfaranden.

En av utmaningarna i neurovetenskap är visualiseringen av neuronal krets ledningar och enskilda celler i intakt hjärnvävnad. Tills nyligen, visar kopplingarna mellan nervceller på detta sätt krävs en) seriesnittning av vävnader, 2) molekylär märkning av specifika mål, såsom axoner eller proteiner; och 3) visualisering av 3D-rekonstruktion av hela hjärnan via beräknings registrering eller anpassning av 2D serie bilder 1. Dessa steg är arbetskrävande, kräver en hel del tid, och riskerar att förlora information under sektionering och märkning, vilket neuronala nätverk kartläggning ytterst svårt. Emellertid har många metoder som möjliggör visualisering av intakt vävnad utan snittning utvecklats. Biologiska vävnader kan göras optiskt transparent genom vävnads clearing tekniker 2-10. En av de stora metoder är att minska brytningsindexskillnader mellan den intakta vävnaden och nedsänkning lösningen föratt minska ljusspridning i intakt vävnad, vilket gör vävnaden transparent och möjliggör observation av djupa strukturer. Vissa typer av dopplösningar har hydrofoba egenskaper, vilket resulterar i snabb fluorescerande härdning under uttorkning förfarande. Därför, dessa metoder är inte kompatibla med fluorescerande avbildning över en lång tidsperiod 11,12. I stället för hydrofoba reagens, andra metoder använder hydrofila reagens för vävnads clearing, såsom SeeDB 4 och Sca l e 6, som upprätthåller den strukturella information och fluorescens av biologisk vävnad 4,6,8. Emellertid makromolekyler, inklusive antikroppar, kan inte nå kärnan i intakt vävnad genom diffusion enbart. Därför är pre-märkning av målmolekyler i djupa områden av tätt packade vävnaderna tekniskt utmanande. I en nyligen utvecklad vävnads clearing metod, CLARITY 3, en hydrogel-inbäddad biologisk vävnad is som bildas med akrylamid, och lipider avlägsnas genom elektrofores under natriumdodecylsulfat (SDS) -innehållande lösningen. Provet sänks därefter ned i en lösning med en matchande reflekterande index för att minska ljusspridning 3. Lipid borttagningssystemet ändrades senare i avancerad CLARITY 13 och PACT (passiv klarhet teknik) 10. Efter polymerisation, kedjor akrylamid tvärbinda med proteiner och bildar hydrogel-vävnad. Lipidkomponenter kan inte tvärbinda med akrylamid; sålunda kan lipider elimineras genom elektrofores under SDS-innehållande buffert. Genom aktiv eliminering av lipider, ökar hjärnvävnad markant öppenhet 9. Emellertid inte dessa metoder inte upp det omöjliga i djup märkning genom fri diffusion. För att övervinna denna begränsning, är tekniker för aktiv transport av reagens i de djupaste delarna av tjocka vävnader krävs. Även CLARITY tillåter vävnad clearing och djup vävnadvisualisering, är det inte en lätt eller snabbt förfarande. Det kan ta flera veckor för att rensa en hel mushjärna 7,14. Snabb clearing av vävnader är viktigt för tillämpningen av sådana metoder på grundläggande eller kliniska laboratoriemiljö för biovetenskaplig forskning eller volym diagnos. Det nuvarande protokollet ger en förenklad process för biologisk vävnad tillstånd och efterföljande proteindetektion genom tryckassisterad leverans immunofärgning. Den är lämplig för hög upplösning volym avbildning av stora arkiveras och 3D-databehandlingssystem genom kombination med avbildningsmetoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Identifieringen och utforskning av den detaljerade organisation av organ eller hela kroppen på cellnivå är grundläggande utmaningar i biologi. Övergångs metoder kräver en avsevärd tid och ansträngning för att få en 3D-bild och med sektionering av intakt vävnad, immunmärkningen och bildbehandling seriesektion vävnad, vilket ger en förlust av information vid varje steg i processen. I nyligen utvecklade metoder för hög upplösning avbildning inom intakt vävnad, har molekylär karakterisering begränsats till märkning av proteiner. Men för närvarande tillgängliga protokoll för organ clearing kräver en betydligt lång process tid, vilket gör det svårt att genomföra vävnad clearing tekniker i labbet. Vi etablerade nyligen ett snabbt och högt reproducerbar protokoll kallas ACT-PRESTO (en ctive c korrekthet t echnique- p ryck r upprymd e fficient och s bord t verförav makromolekyler in o rgans), som gör det möjligt för vävnads clearance inom flera timmar. Dessutom ACT-PRESTO möjliggör snabb immunomärkning med konventionella metoder och accelererar penetrationen antikropp i den djupa lager av tätt formade, tjocka prover genom att applicera tryck eller konvektion flödet. Vi beskriver hur man förbereder vävnader, hur man rensar med lipid borttagning med hjälp av elektrofores, och hur man immun färga av en tryckassisterad leverans. Snabbheten och konsekvens av protokollet kommer att påskynda utvecklingen av 3D histologiska forskning och volymbaserade diagnoser.

ACT-vävnads Clearing En viktig faktor som påverkar vävnad clearing är vävnadsfixering. PFA fixering och infusions akrylamid är separata steg i detta protokoll. Efter det att vävnaden-hydrogel polymerisationssteget är den fria A4P0 lösning inte polymeriseras, även om vävnads infunderas hydrogeler är tvärbundna med endogena makromolekyler. Därför bör ingen gel bildar utsidan av vävnader (Figur 2A). ACT förfarande resulterar i mindre tvärbindning mellan proteiner och akrylamid jämfört med CLARITY-protokollet. Följaktligen är det vävnads hydrogel provet mer porös. Denna funktion gör det möjligt att snabbt utvinning av lipider och spridningen av makromolekyler. Delar av mushjärna 1- till 2 mm tjock var tillräckligt rensas inom 1-2 h (figur 2B), och 5-6 h ETC var tillräcklig för clearance av hela mushjärnor (figur 2C). Hydrogel-medierad vävnad clearing inducerade expansionen av vävnaden efter ETC steg, men vävnaden tillbaka till sin ursprungliga storlek i reflekterande index matchade lösning. Vävnaden-hydrogel prov bildas i ACT förfarande är mycket porös, och således, kunde små föreningar och makromolekyler tränger effektivt och diffundera lätt (Figur 3). Efter en 2-h inkubation av en-mm hjärnan skivor med tyrosinhydroxylas (TH) och kollagen typ IV-antikropp, en efterföljande 2-h inkubering med en sekundär antikropp var tillräcklig för att märka dopaminerga neuroner på en 500 | im djup (Figur 3) . PRESTO-vävnad immunomärkning Täta organ har i allmänhet höga koncentrationer av ECM fibrer, vilket påverkar genomträngningen av antikroppar i vävnaderna. Således antikroppar Penetrated till ett djup av endast 20-30 | j, m i täta vävnader, såsom njurvävnad, efter 12 h inkubation. För att övervinna denna begränsning, utformade vi aktiva makromolekyl penetrations metoder som möjliggör leverans av reagens i djupa vävnader, nämligen PRESTO (tryckrelaterade effektiv och stabil överföring av makromolekyler i organ) (Figur 4). Jämfört med den statiska inkubation av ACT-behandlade njurvävnad med antikroppslösningar, tillämpningen av centrifugalkrafter (600 xg) med en bordscentrifug (centrifugal Presto, c-Presto) förbättrats avsevärt antikropps leverans i djup vävnad (Figur 5). När vi tillämpade c-PRESTO förfarande tät vävnad, 3 h inkubation var tillräcklig för att märka 250 till 300 um djupa strukturer. För att förbättra vävnadsdistorsion utan betydande vävnadsskada, utformade vi också en maskin som ger konvektion flöde med en sprutpump (spruta PRESTO, s-Presto). Denna process liknande förbättrade pe antikroppsnetration jämfört med passiv diffusion (Figur 5). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figur 1. Framställning av s-PRESTO apparat. A. En spruta (30 ml) och trevägskran. B. trevägskran ansluten och limmas till sprutan. C. spruta innehållande provet och antikroppslösningen, och sprutan placeras på sprutpump. D. Sprutpumpen och skick setup. E. Pumpen infuserar en lösning innehållande märkningsreagens in i provet. När den utsedda volym uppnåtts, pumpriktningen ändras och drar lösningen efter en angiven tidsperiod. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 2. ACT vävnads clearing av mushjärna. A. Efter polymerisation är gratis A4P0 lösningar inte polymeriseras; vävnads infunderas hydrogeler gelatinerad genom tvärbindning med endogena makromolekyler. B. 1- till 2-mm tjocka hjärnan skivor röjdes för 1 - 2 h, och graden av expansion och storlek återhämtning i reflekterande index (RI) -Matchning lösning registrerades. C. Tjockleken på hela mushjärna är ca 0,8 cm, och 5-6 h av ETC var tillräcklig för att fullständigt klart hjärnan. Efter 3 h av ETC, fanns det en signifikant mängd av icke-rensas vävnad. Med 6 h av ETC, dock, röjning av hela hjärnan hade inträffat. Färgen på vävnader efter ACT i ETC bufferten är vit eller opak. RI justering vävnader blir genomskinlig. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Klicka henne</a>e för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figur 3. immunomärkning med ACT-rensas mus hjärnvävnad. Bilder av ACT-bearbetat en mm mus hjärnan skivor visar mushjärna cortex färgas med en antikropp mot kollagen typ IV och en del av mellanhjärnan färgas med en antikropp mot tyrosinhydroxylas (TH). Skalstock, 100 | j, m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figur 4. PRESTO immunomärkning metoder. Antikroppar kan inte tränga in i täta vävnader genom diffusion. PRESTO immunomärkning metoder utformade för att aktivt ingjuta makromolekyler och leverera reagens itäta vävnader. Tillämpningen av centrifugalkrafter med en vanlig bordscentrifug (centrifugal Presto, c-Presto) markant underlättat leveransen av antikroppar. Appling konvektion flöde med en sprutpump (sprutan Presto, s-Presto) förbättrad penetrations antikropp. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figur 5. PRESTO immunmärkningen av ACT-rensas tät vävnad. För c-PRESTO ades vävnaderna centrifugerades vid 600 xg under 3 timmar med en vanlig bordscentrifug för att påskynda penetrationen av primära och sekundära antikroppar. För s-Presto, var en sprutpump används för att leverera antikropparna. Mus organ, såsom njurarna och levern, märktes med kollagen av typ IV. Jämfört med konventionella metoder, 3 h avC- eller S-PRESTO ökar markant märknings djup. I njurarna och levern, djupet av Z-axeln når 300-350 pm eller djupare i PRESTO prover (till höger), medan kontrollprover är märkta på ett djup av endast 40-50 m (till vänster). En rekonstruerad 3D-bild erhölls med ett konfokalmikroskop. Skalstock, 100 | j, m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (aktiv klarhet teknik-tryck relaterade effektiv och stabil överföring av makromolekyler i organ) möjliggör snabb, effektiv, men billig vävnad clearing och snabb penetration antikropp i rensas vävnader genom passiv diffusion eller tryckassisterad leverans. Med användning av denna metod kan ett brett spektrum av vävnader rensas immunolabeled av flera antikroppar, och volym-avbildas.

ACT-PRESTO: biologisk vävnad Clearing och immunomärkning Metoder för Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Metoder för studier av Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Syntes och kalibrering av Phosphorescent Nanoprobes för Oxygen Imaging i biologiska system

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volym segmentering och analys av biologiska material använda Workbench för SuRVoS (Super region volym segmentering)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Äggextraktberedning och levande avbildningsmetoder för visualisering av dynamisk cytoplasmatisk organisation

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiska vävnadsprover

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk röjning av växtvävnader för fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...