Name: 2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00
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JDM è stato sostenuto da una borsa di dottorato in INSERM / Région Aquitaine ed è ora supportata da una borsa di studio post-dottorato ARC e dall&#39;Istituto Tisch Cancer presso la Scuola di Medicina del Monte Sinai. EH è sostenuto da un dottorato di ricerca presso il Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE è sostenuta da una borsa post-dottorale di Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM è sostenuto dal Tisch Cancer Institute presso la Scuola Superiore di Medicina del Sinai e JJBC è sostenuta dalla sovvenzione NIH / NCI K22CA196750, dal Fund JJR del Giovane Scienziato TCI e dal Tisch Cancer Institute presso la Scuola di Medicina del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS è supportata dal &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM e FS sono supportati da finanziamenti provenienti da &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale Contre le Cancer 2016&quot; e Institut National du Cancer, INCA_8036 e PLBio2012.

NOTA: Prima della fissazione, tutti i passaggi sono completati in un cappuccio flusso laminare sterile. 1. Matrice 2D NOTA: le matrici 2D vengono utilizzate per determinare la percentuale di cellule che formano gli invasomi e l&#39;area di degradazione della matrice per cellula. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Figura 1: Protocollo. Sintesi del protocollo utilizzato per...

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	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. 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Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Classicamente, gli invasomi sono studiati in vitro senza riguardo al microambiente e alla matrice su cui sono plasmate le cellule. Attualmente vengono utilizzati diversi tipi di matrici, tra cui gelatina, fibronectina, vitronetina o collagene fibrillare ad alta densità (HDFC) 7 , 11 ; Tuttavia, queste non sono spesso rappresentative del microambiente in cui le cellule risiedono e non sono fisiologicamente rilevanti. Qui è stato utilizzato un nuovo tip...

La rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) si verifica durante processi fisiologici e patologici, come l&#39;angiogenesi e l&#39;invasione delle cellule tumorali. In condizioni fisiologiche, molti tipi di cellule, soprattutto dalla linea ematopoietica, sono in grado di degradare gli elementi di ECM. Ad esempio, i macrofagi sono in grado di attraversare barriere anatomiche per raggiungere i tessuti e gli osteoclasti degradano la matrice ossea per garantire l&#39;omeostasi del calcio. Più in tutto il mondo, tutte le matrici del corpo rinnovano per mantenere le proprie proprietà fisiche e chimiche. Nei tessuti del cancro, la composizione del microambiente del tumore è alterata. Ad esempio, nel cancro al seno e nel polmone, il collagene di tipo I è sovraespresso e si accumula intorno al tumore. Inoltre, questo accumulo è associato ad un aumento del rischio di sviluppare metastasi 1 , 2 . La metastasi del cancro dipende dalla capacità delle cellule tumorali di degradare l&#39;ECM e di invadere i tessuti adiacenti. IlL&#39;attività invasiva delle cellule è attribuita a strutture specializzate ricche di actina note come invadosomi. Questo termine comprende i podosomi e l&#39;invadopodia, presenti rispettivamente nelle cellule normali e cancerose ( ad es. Macrofagi, cellule endoteliali e cellule tumorali come la linea cellulare MDA-MB-231). In vitro , gli invasori possono organizzare in forme diverse: punti, aggregati o rosette 3 . Classicamente, gli invasomi sono costituiti da un nucleo di F actin contenente diverse proteine, come la proteina Tks5 e la corattina, circondate da molecole di placca adesiva, come integrine e vincolina 4 . Recentemente, è stato dimostrato che Tks5 e RhoGTPase Cdc42 possono essere utilizzati come una firma molecolare minima per gli invasomi funzionali 5 . Queste strutture sono in grado di degradare l&#39;ECM attraverso il reclutamento e l&#39;attivazione di proteine ​​metalloproteasiche specifiche, come MT1-MMP e MMP-2 6. In uno studio precedente, abbiamo riportato che l&#39;interazione tra i fibrille di collagene di tipo I e il recettore del dominio discoidico 1 (DDR1), un recettore specifico di fibrille di collagene di tipo I, porta alla formazione di una nuova classe di invasomi, chiamati invadosomi lineari. Gli invasomi lineari sono formati lungo fibrille di collagene di tipo 7 . Queste strutture sono in grado di degradare fibrille di collagene di tipo I attraverso il reclutamento e l&#39;attivazione di MT1-MMP / MMP2. Inoltre, la loro formazione dipende da Tks5 e Cdc42 5 . In vitro abbiamo dimostrato l&#39;esistenza di invadosomi lineari e il coinvolgimento di DDR1 nella loro formazione e nell&#39;attività 8 usando strategie diverse costituite da una combinazione di vari elementi di matrice, tra cui: i) copertine fluorescenti rivestite in gelatina, ii) fibrille collagene fluorescenti di tipo I E iii) spine 3D di tipo collageno. A causa dell&#39;utilizzo di diverse matrici, siamo stati in grado di studiare e di carattereÈ una formazione lineare invadente e la loro attività di degradazione 7 , 8 . Infine, per comprendere meglio la biologia delle cellule invasive, è stata utilizzata una combinazione di componenti ECM in entrambi i sistemi di coltura 2D e 3D, simulando la complessità della composizione del microambiente tumorale. Di seguito sono riportati i protocolli per rivestimenti di rivestimento con collagene di gelatina / tipo I nei sistemi di coltura 2D e 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

L&#39;adesione cellulare, la migrazione e l&#39;invasione sono coinvolti in molti processi fisiologici e patologici. Ad esempio, durante la formazione di metastasi, le cellule tumorali devono attraversare barriere anatomiche per invadere e migrare attraverso il tessuto circostante per raggiungere i vasi sanguigni o linfatici. Ciò richiede l&#39;interazione tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM). A livello cellulare, molte cellule, tra cui la maggior parte delle cellule tumorali, sono in grado di formare invasomi, che sono strutture a base di F-actin in grado di degradare ECM. Invadosomi sono strutture protettivali di actina che reclutano e attivano matrici metalloproteinasi (MMPs). La composizione molecolare, la densità, l&#39;organizzazione e la rigidità del ECM sono cruciali nella regolazione della formazione invasiva e dell&#39;attivazione. In vitro , un test di gelatina è il saggio standard utilizzato per osservare e quantificare l&#39;attività di degradazione invadente. Tuttavia, la gelatina, che è denaturato il collagene I, non è una matrice fisiologica element. È stato sviluppato un nuovo saggio con fibrille di collagene di tipo I e utilizzato per dimostrare che questa matrice fisiologica è un potente induttore degli invasomi. Gli invadosomi che formano lungo i fibrille del collagene sono conosciuti come invadosomi lineari a causa della loro organizzazione lineare sulle fibre. Inoltre, l&#39;analisi molecolare degli invasomi lineari ha mostrato che il recettore del dominio di discoidina 1 (DDR1) è il recettore coinvolto nella loro formazione. Questi dati dimostrano chiaramente l&#39;importanza di utilizzare una matrice fisiologicamente rilevante al fine di comprendere le complesse interazioni tra le cellule e l&#39;ECM.

Utilizzando una combinazione di due tipi di matrici, gelatina e collagene di tipo I ( figure 1 e 4 ), abbiamo evidenziato un nuovo tipo di invasione, conosciuto come invadosomi lineari. L&#39;etichettatura di queste matrici permette l&#39;osservazione della formazione invasima lineare lungo le fibre del collagene I e delle loro capacità di degradazione ( Figura 5 ). Il numero di strutture invasive può quindi essere quantificato dalla m...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Questo protocollo descrive come preparare una matrice misti 2D, composta da gelatina e collagene I, e un collega di collagene 3D per studiare gli invasomi lineari. Questi protocolli consentono lo studio della formazione invasiva lineare, l&#39;attività di degradazione della matrice e le capacità di invasione delle cellule primarie e delle linee cellulari del cancro.

Matrici 2D e 3D per studiare formazione e attività lineare invazienti

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