Name: 2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00
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O JDM foi apoiado por uma bolsa de doutorado do INSERM / Région Aquitaine e agora é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do ARC e o Tisch Cancer Institute na Mount Sinai School of Medicine. A EH é apoiada por um doutorado do Ministério da Educação Superior e da Investigação. A ZE é apoiada por uma bolsa pós-doutoral da Agência Nacional de Pesquisa (ANR). O CM é apoiado pelo Instituto de Câncer Tisch na Faculdade de Medicina Mount Sinai e JJBC é apoiado pela concessão do NIH / NCI K22CA196750, o Fundo JJR do Prêmio Científico Científico da TCI e pelo Instituto Tisch Cancer na Escola de Medicina Mount Sinai. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS é apoiado pela &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM e FS são suportados pelo financiamento da &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; e Institut National du Cancer, INCA_8036 e PLBio2012.

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril. 1. matriz 2D NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gela...

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	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. 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Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. 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Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) 7 , 11 ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo...

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de pulmão, o colágeno de tipo I é sobre-expressado e se acumula em torno do tumor. Além disso, essa acumulação está associada a um risco aumentado de desenvolver metástases 1 , 2 . A metástase do câncer depende da capacidade das células cancerosas para degradar o ECM e invadir os tecidos adjacentes. oA atividade invasiva das células é atribuída a estruturas especializadas em ricas em actinas conhecidas como invadosomes. Este termo inclui podossomas e invadopodia, que estão presentes, respectivamente, em células normais e cancerígenas ( por exemplo, macrófagos, células endoteliais e células cancerosas, como a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231). In vitro , os invadosomes podem se organizar em diferentes formas: pontos, agregados ou rosetas 3 . Classicamente, os invadosomes são compostos de um núcleo de F-actina contendo várias proteínas, como a proteína de andaimes Tks5 e cortactina, cercada por moléculas de placa de adesão, como integrinas e vinculina 4 . Recentemente, mostrou-se que a TK5 e a RhoGTPase Cdc42 podem ser usadas como uma assinatura molecular mínima para invadosomas funcionais 5 . Essas estruturas são capazes de degradar o ECM através do recrutamento e ativação de proteínas de metaloprotease específicas, como MT1-MMP e MMP-2 6. Em um estudo anterior, relatamos que a interação entre as fibrilas de colágeno tipo I e o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1), um receptor específico de fibrilas de colágeno tipo I, leva à formação de uma nova classe de invadossomas, denominados invadossomas lineares. Os invadosomas lineares são formados ao longo de fibrilas de colágeno tipo I 7 . Essas estruturas são capazes de degradar fibrilas de colágeno tipo I através do recrutamento e ativação de MT1-MMP / MMP2. Além disso, sua formação depende da Tks5 e Cdc42 5 . In vitro , demonstramos a existência de invadossomas lineares eo envolvimento de DDR1 na sua formação e atividade 8 usando diferentes estratégias consistindo em uma combinação de vários elementos da matriz, incluindo: i) lamínulas fluorescentes revestidas com gelatina, ii) fibrilação de colágeno tipo I fluorescente Lamelas revestidas e iii) tampas de colágeno 3D tipo I. Devido ao uso de diferentes matrizes, pudemos estudar e caracterizarFormação de invadosoma linear e sua atividade de degradação 7 , 8 . Finalmente, para compreender melhor a biologia das células invasivas, utilizou-se uma combinação de componentes de ECM nos sistemas de cultura 2D e 3D, imitando a complexidade da composição do microambiente do tumor. Abaixo estão protocolos para revestimento de lamínulas com colágeno de gelatina / tipo I em sistemas de cultura 2D e 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormen...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

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