Name: 2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity at JoVE.com

JDM поддерживалась стипендией PhD от INSERM / Région Aquitaine и в настоящее время поддерживается последипломным отделением ARC и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. EH поддерживается доктором философии от Министерства обороны и де ла Recherche. ZE поддерживается пост-докторской стипендией от Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM поддерживается Институтом рака Тиша в Медицинской школе горы Синай, а JJBC поддерживается грантом NIH / NCI K22CA196750, Фондом JJR Фонда исследований рака молочной железы TCI и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. Эта работа была поддержана грантом ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS поддерживается «Национальной лигой борьбы с раком». VM и FS поддерживаются при финансовой поддержке «Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016» и Национального института рака, INCA_8036 и PLBio2012.

ПРИМЕЧАНИЕ. Перед фиксацией все этапы завершаются в стерильном ламинарном вытяжном шкафу. 1. 2D-матрица ПРИМЕЧАНИЕ. 2D-матрицы используются для определения процента клеток, образующих инвадусомы, и площади деградации матрицы на ячейку. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

<ol>
	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis.">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Tks5:+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes.">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li><li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+invasion+by+tumour+cells:+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia.">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes.">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119 (2012).</li><li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+detection+and+gelatin+degradation+assay.">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li><li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network.">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Классически интрадосомы изучаются in vitro без учета микроокружения и матрицы, на которой покрыты клетки. В настоящее время используются несколько типов матриц, включая желатин, фибронектин, витронектин или фибриллярный коллаген высокой плотности (HDFC) 7 , ...

Ремоделирование внеклеточной матрицы (ECM) происходит во время физиологических и патологических процессов, таких как ангиогенез и инвазия опухолевых клеток. В физиологических условиях многие типы клеток, в основном из гематопоэтической линии, способны деградировать элементы ECM. Например, макрофаги способны пересекать анатомические барьеры для достижения тканей, а остеокласты разрушают костный матрикс для обеспечения гомеостаза кальция. Более глобально все матрицы в организме восстанавливаются, сохраняя свои физические и химические свойства. В раковых тканях состав микроокружности опухоли изменяется. Например, при раке груди и легкого коллаген I типа сверхэкспрессируется и накапливается вокруг опухоли. Более того, это накопление связано с повышенным риском развития метастазов 1 , 2 . Раковые метастазы зависят от способности раковых клеток разрушать ECM и вторгаться в смежные ткани. Инвазивная активность клеток объясняется специализированными актино-богатыми структурами, известными как интрадосомы. Этот термин включает подзомы и инвадоподии, которые присутствуют, соответственно, в нормальных и раковых клетках ( например, макрофагах, эндотелиальных клетках и раковых клетках, таких как клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231). In vitro , интрадосомы могут организовываться в разные формы: точки, агрегаты или розетки 3 . Классически интрадосомы состоят из ядра F-актина, содержащего несколько белков, таких как белок Taff5 и кортатин, окруженный молекулами адгезионной бляшки, такими как интегрины и винкулин 4 . Недавно было показано, что Tks5 и RhoGTPase Cdc42 могут быть использованы как минимальная молекулярная сигнатура для функциональных инвадосом 5 . Эти структуры способны разрушать ECM посредством рекрутирования и активации специфических белков металлопротеазы, таких как MT1-MMP и MMP-2 6, В предыдущем исследовании мы сообщали, что взаимодействие между фибриллами коллагена типа I и рецептором домена discoidin 1 (DDR1), специфическим рецептором фибрилл коллагена I типа, приводит к образованию нового класса инвадосом, называемых линейными инвадосомами. Линейные инвадомости образуются вдоль коллагеновых фибрилл I типа 7 . Эти структуры способны разрушать фибриллы коллагена I типа путем набора и активации MT1-MMP / MMP2. Более того, их образование зависит от Tks5 и Cdc42 5 . В пробирке мы продемонстрировали существование линейных интрадосом и вовлечение DDR1 в их формирование и активность 8, используя различные стратегии, состоящие из комбинации различных матричных элементов, в том числе: i) люминесцентные покрытые желатином покровные стекла, ii) флуоресцентный коллагеновый фибрилл I типа Покрытые покровным покрытием, и iii) вилки с коллагеном типа I. Из-за использования разных матриц мы смогли учиться и характеризоватьсяА также их деградирующей активности 7 , 8 . Наконец, чтобы лучше понять биологию инвазивных клеток, была использована комбинация компонентов ECM в системах 2D и 3D культуры, имитирующих сложность состава микроокружения опухоли. Ниже приведены протоколы покрытия покровных стекол желатином / типом I в системах 2D и 3D культуры.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

Клеточная адгезия, миграция и инвазия участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Например, во время образования метастазов опухолевые клетки должны пересекать анатомические барьеры, чтобы вторгнуться и мигрировать через окружающую ткань, чтобы достичь кровеносных или лимфатических сосудов. Для этого требуется взаимодействие между клетками и внеклеточным матрицей (ECM). На клеточном уровне многие клетки, включая большинство раковых клеток, способны образовывать инвадусомы, которые представляют собой структуры на основе F-актина, способные разрушать ECM. Invadosomes - это протрузивные актиновые структуры, которые рекрутируют и активируют матриксные металлопротеиназы (MMP). Молекулярный состав, плотность, организация и жесткость ECM имеют решающее значение для регулирования образования и активации инвадосом. В пробирке анализ желатина является стандартным анализом, используемым для наблюдения и количественного определения активности деградации инвадосом. Однако желатин, являющийся денатурированным коллагеном I, не является физиологической матрицей element. Был разработан новый анализ с использованием коллагеновых фибрилл I типа, который показал, что эта физиологическая матрица является мощным индуктором интрадосом. Инвадосомы, которые образуются вдоль коллагеновых фибрилл, известны как линейные инвадосомы из-за их линейной организации на волокнах. Более того, молекулярный анализ линейных интрадосом показал, что рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) является рецептором, участвующим в их образовании. Эти данные наглядно демонстрируют важность использования физиологически релевантной матрицы для понимания сложных взаимодействий между клетками и ECM.

Используя комбинацию двух типов матриц, желатина и коллагена I типа ( рис. 1 и 4 ), мы выделили новый тип инвадомоз, известный как линейные интрадосомы. Маркировка этих матриц позволяет наблюдать формирование линейной инвадосомы вдоль волокон коллаген?...

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity at JoVE.com

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.

2D и 3D-матрицы для изучения формирования и активности линейных инвадосом

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Улучшение 2D и 3D кожи<em&gt; In Vitro</em&gt; Модели Использование макромолекулярных Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий<em&gt; В Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

У млекопитающих деление клеток в 3D матрицы через количественного отражения конфокальная микроскопия

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Альгинатные/желатин гидрогеля 3D в Vitro модель системы вызывать клетки сфероида образование

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Роман процесс для 3D печати Decellularized матрицы

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Стандартизированные и масштабируемые анализ для изучения Перфированный 3D ангиогенной прорастания iPSC полученных эндотелиальных клеток в Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D-биопечать фотонастраиваемых гидрогелей для изучения активации фибробластов

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...