Name: combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography of the mouse hindlimb to study insulin-induced vasodilation and muscle perfusion
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion at JoVE.

Vi takker Ing. Duncan van Groen for programmering bildet analyseprogramvare (ImageGrabber) brukt i denne studien. Finansiering for denne forskningen er levert av et VIDI stipend fra Netherlands Organisation for vitenskapelig forskning (grant 016.136.372).

Alle dyreforsøk er godkjent av lokale dyr omsorg og etisk komité. Hele protokollen fra induksjon av anestesi i musen til slutten av hyperinsulinemic-euglycemic klemmen tar ca 2 timer.
1. Mikrokirurgiske forberedelse
<ol><li>Indusere anestesi samt analgesi i en mannlig mus veier 20-25 g etter en 14 h eller over natten faste med en intraperitoneal injeksjon av Fentanyl (0.31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) og Acepromazine (6,25 mg/kg) (FMA anestesi) og plassere den på en endetarms temperatur-kontrollert homeothermic oppvarming pad som opprettholder kroppstemperatur på 37 ° C.</li>
	<li>Desinfiser tabellen drift og utstyr flere ganger med en alkohol-basert løsning.</li>
	<li>Knytt en 27 G nål slik 10 cm lang polyetylen (PE-20) og feste tuben til en 4-veis kobling. Sette inn nålen i halen stemning og fixate med vev selvklebende gel. Denne kanyle brukes for tilførsel av microbubbles, insulin, glukose og anestesi. Merk: Legge Heparin (5 U/mL) i sterilt saltvann under cannulation prosessen å spyle hale venen (ca. 10 µL) reduserer muligheten for tette cannulas.</li>
	<li>Hele kirurgiske prosedyrer og eksperimentelle protokoller, opprettholde anestesi ved en kontinuerlig intravenøs infusjon av FMA anestesi via hale blodåre kanyle med hastighet på 33.75 µL/kg/min.</li>
	<li>Plasser musen med ventral side opp og fikse føttene på en thermostable tape for å avsløre det øvre lår-området. Bruk en liten exorotation av hofteleddet (hindlimb paws vender) og en 40-60° vinkel på kneet felles for å standardisere strekningen av muskel på den adductor kupeen av låret.</li>
	<li>Fjerne håret på lysken og øvre lår områder bilateralt ved hjelp av en depilatory fløte. Samle all løs hår med en fuktig bomullspinne.</li>
	<li>Plasser musen under en stereomicroscope og gjør kirurgiske følgende bruker 10 X til 16 X forstørrelse.</li>
	<li>Gjøre en 2 cm snitt med huden saks parallelt lysken ligament, bare lateralt abdominal kurvatur (figur 1). Bruke trekkraft på den distale siden av innsnitt distally bruker en bulldog klemme (figur 1 d). Dette vil bidra til å justere vinduet etter behov og bidra til å holde parafinolje (beskrevet i 1.12).</li>
	<li>Dissekere fettvev fra bukveggen. For å unngå blødning, forsiktig skille fett puten fra veggen i stedet for dissekere direkte gjennom puten. Mild trekkraft på fett puten i distale retning vil forenkle prosessen (figur 1 c).</li>
	<li>Identifisere femoral arterien og følger den ned til de første store grenene (epigastric arterien og arteria gracilis) (figur 2). Arteria gracilis er den første store grenen av arteria femoral kjører på den adductor magnus muskelen og deretter går dypt gracilis muskelen. Arteria gracilis skal brukes for IVM.</li>
	<li>Identifisere gjennomsiktig dype fascia dekker musklene og fartøyene. Bruke skarpe tang, trekke fascia oppover og kutt den med en microscissor.</li>
	<li>Dekker eksponert muskler med en dråpe (200 µL) av medisinsk flytende parafin (romtemperatur eller pre varmet til 37 ° C) å hindre forberedt vevet tørker ut. Kontroller at olje fall ikke lekke bort. Justere huden kaster av innsnitt bruker bulldog klemmen til å lage et lite hulrom å holde parafinolje som bader fartøyene.</li>
	<li>Plass musen under tidligere kalibrert mikroskop (16 X optisk forstørrelse) slik at arteria gracilis er loddrett på skjermen. Knytte mikroskopet til et kamera og en datamaskin basert analysesystem som kan trekke ut i fartøy diameter fra bildet datasettet. Diameteren er avstanden mellom de to luminal sidene av fartøyet. Kontinuerlig overvåking og måling av arterien diameter er ønskelig.</li>
	<li>Plass lyskilden på nok avstand (minimum 20 cm) fra hindlimb å redusere hodet ledning fra lyset.</li>
	<li>Bruke prewarmed ultralyd signaltransduksjon gel på den øvre kontralateral hindlimb. Plass den ultralyd proben vinkelrett på den lange aksen av det femur ben.</li>
	<li>Nøye justere vinkel og retning av ultralyd sonden å se tverrsnitt av gruppen adductor muskel. Pass på å holde plasseringen av ultralyd sonden i forhold til musen stabil å holde samme tenkelig plan for opprinnelig plan og hyperinsulinemic mål.</li>
	<li>La musen stabilisere seg 30 min. Diameteren på arteria gracilis bør være stabile på 10 min før dokumentere den opprinnelige diameteren.</li>
</ol>2. baseline og Hyperinsulinemic mål
<ol><li>Kontroller at den planlagte gracilis arterie diameteren lagres av programmet brukes for IVM.</li>
	<li>Forberede microbubbles på forhånd som beskrevet35 og telle med Coulter telleren til en konsentrasjon av 2.5 x 109 bobler/mL like før eksperimentet.</li>
	<li>
Som bare kan ses i microbubbles i kontrast-modus på ultralyd maskinen, kontrollere parametrene som påvirker bildet og kontrast samles (beskrevet i 2.3.1) og bruk konsekvent under oppkjøpet.
	<ol>
<li>Bruk følgende innstillinger på ultralyd maskinen: kontrast gevinst på 35 desibel; tiden få kompensasjon til OFF; Linje tetthet til høy; Antall fokus soner widescreen; Overføre makt til 4%. Overføre stråle bredde til STANDARD; SV Gate til 4; Følsomhet 1. Utholdenhet av. Nivå hvor fokus soner til midten av regionen av interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lagre en kort (5 s) klipp. Dette vil bli brukt til å beregne bakgrunn signalet.</li>
	<li>Riste ampullen inneholder microbubbles for hånd for å ha en jevn hjuloppheng. Infusjonen microbubbles med halen blodåre kanyle til 5 µL/min pris. Plass infusjon røret på en vibrerende vortex (200 x per min) for å opprettholde en jevn suspensjon av microbubbles.</li>
	<li>Tillate 5 min av kontinuerlig infusjon av microbubbles slik at en stabil nivå er nådd. Fortsett med å skaffe tid intensitet kurvene i boblene ved hjelp av funksjonen for microbubble ødelegge (MBD) på ultralyd maskinen 10 min og 5 min etter starten av microbubbles infusjon (figur 3A). Ta gjennomsnittlig signalet fra disse to mål å få opprinnelige perfusjon data.</li>
	<li>
Etter å starte de opprinnelige dataene, hyperinsulinemic-euglycemic klemme som beskrevet34. Bruk hale kanyle (plassert i 1.3) til å administrere insulin og glukose (og anestesi).
	<ol>
<li>Kort sagt, indusere en hyperinsulinemic tilstand ved å innføre en 200 mU/kg insulin bolus etterfulgt av kontinuerlig insulin infusjon (7,5 mU/kg/min) for 60 min. Bruk en variabel infusjon av 20% D-glukose å opprettholde euglycemia.</li>
		<li>Vurdere blodsukker fra halen venen hver 5 min med en glukose overvåking enhet og vedlikeholde på 5 mM ved å justere infusjonshastigheten variabel glukose. Bestemme insulinfølsomhet ved snitt mener glukose infusjonshastigheten i løpet av de siste 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontroller at diameteren på arteria gracilis er dokumentert i de ønskede tidsperiodene (for eksempel på 10, 30 og 60 min) i starten av hyperinsulinemic-euglycemic klemmen med programmet.</li>
	<li>Etter 25 min, og/eller 55 min av insulin klemmen, starte andre (hyperinsulinemic) CEUS målingen for å dokumentere MBV 30 og/eller 60 minutter, henholdsvis. Følg de samme trinnene beskrevet i 2.4 og 2.5. Koble fra og bruke anestesi porten til 4-veis kobling å sette mot i microbubbles. Koble anestesi røret etter microbubbles infusjon.</li>
	<li>Etter at IVM og CEUS målinger 60 min etter starten av insulin infusjon, trekke blod fra musa av hjertet punktering fremgangsmåte for senere analyse. Dette vil også euthanize musen. Nøye analysere gracilis og femoral arterier og lagre dem for ytterligere ønsket eksperimenter (for eksempelvestlige blots, Immunohistochemistry, ex vivo press myography eksperimenter36,37, 38).</li>
</ol>3. frakoblet analyse

Merk: Analyser av IVM og CEUS målinger skal utføres frakoblet av en blendet etterforsker. CEUS tilbyr muligheten til å skille mikrosirkulasjonen fra større fartøy ved midlertidig destruering microbubbles av høy intensitet ultralyd bølger funksjonen MBD. Signalet (målt i vilkårlig enheter (a.u)) i større fartøy gjenopprettes raskere enn mikrosirkulasjonen på grunn av microbubbles hastigheten i tilsvarende fartøyer.
<ol><li>Bruk en frakoblet arbeidsstasjon eller programvaren på ultralyd maskinen til analysene.</li>
	<li>Tegne en region av interesser (ROI) for å inkludere blodsirkulasjonen. Tegn en egen avkastning med større femur fartøyene (figur 3A).</li>
	<li>Dupliser mikrosirkulasjonens og større fartøy ROIs for bakgrunn, planlagt og hyperinsulinemic målingene ved hjelp av funksjonen for ROI-kopi i programvaren.</li>
	<li>Trekk intensitet signalet i bakgrunnen fra grunnlinjen og hyperinsulinemic målinger.</li>
	<li>Fordele intensitet signalet av mikrosirkulasjonen av intensitet signalet av femur fartøyene. Baseline og hyperinsulinemic MBVs kan nå sammenlignes.</li>
</ol>

Visuelle Sonics Inc. dekket åpen tilgang avgifter, mens strukturen og innholdet i artikkelen forble ansvar av forfatterne.

Vi har utviklet en teknikk for å beregne samtidig insulin's vaskulær handlinger for større arteriene (med IVM) og skjelettlidelser muskel mikrosirkulasjonen (med CEUS). Kritisk trinnene for vellykket og pålitelig målinger er: 1) skal utsette arteria gracilis uten blødning; 2) forhindrer lekkasje av parafinolje bading arterien; 3) har en patent venøs tilgang (hale blodåre kanyle) for infusjon av vasoactive forbindelser (insulin) og kontrast agent (microbubbles).
Studiet av mikrovaskulær dysfunksjon i muskel har vært å få oppmerksomhet i sammenheng med fedme og insulin resistens14,25,39,40. Den negative virkningen av fedme og insulinresistens vaskulær funksjonen er manifestert på ulike nivåer av vaskulær treet. Heretter, er ulike tilnærminger nødvendig å vurdere disse endringene. Kombinert bruk av de IVM og CEUS teknikkene i samme musen gir et kraftig verktøy for å kvantifisere insulin's effekter på ulike nivåer av er blodkar. IVM tillater direkte visualisering og kvantitativ analyse av arteria motstand og CEUS tillater for vurdering av insulin-induserte endringer i muskel perfusjon.
Studere adductor muskel rommet har flere fordeler. Arteriene er lett tilgjengelig og overfladiske natur innsnitt gjør det mulig å lukke den hud snittet med en 5.0 absorberbare sterilt Sutur etter at forsøket er ferdig. Dyrene ble injisert subcutaneously med buprenorfin etter eksperimenter som smertestillende på en dose 0,1 mg/kg og lov til å gjenopprette i varme omgivelser. Mus tolerert prosedyren godt og vi opplevde ingen tap av dyr eller infeksjoner i hindlimb i mer enn 35 dyr studerte. Dette gjør det mulig å følge opp eller studere dyrene i en langsgående mote. Dyrene i disse eksperimentene, men var anesthetized med 1,8% inhalert isoflurane balansert med oksygen strømmer på 0,4 L/min om en bedøvelse maske. I motsetning til isoflurane anestesi41,42forstyrrer ikke FMA anestesi perifere insulinfølsomhet. En fremtidig plan er å studere hvor godt musene gjenopprette FMA bedøvelsen.
Adductor muskel rommet er også nyttig siden ulike vasoactive forbindelser formidling lokale og nedstrøms vaskulær effekter kan evalueres. Aktuell anvendelse av disse forbindelsene til vevet er for eksempel mulig bruker superfusion teknikker28 eller kirurgisk manipulasjon og implantering av narkotika-eluting mansjetter rundt fartøy43. Videre kan arteria gracilis være isolert og studert i trykk-myograph. Vår gruppe og andre har samlet betydelig eksperimentelle bevis med press myograph for å dokumentere effekten av insulin og andre vasoactive forbindelser på denne arterien ex vivo36,37,38.
En begrensning som er iboende til bruk av IVM teknikken er kirurgisk gjennomgangen av muskler og anvendelse av parafinolje å stabilisere fartøyene. Det er ikke klart om disse handlingene konsekvenser for native miljøet av arterien. Figur 3A viser imidlertid at opprinnelige diameteren på arteria gracilis badet i parafinolje ikke endres betydelig. Det har også vist at mineralolje er hemmer spredningen av oksygen, beskytte vev fra hyperoxic forhold44. Videre bidrar olje til å redusere variasjonen i den opprinnelige diameteren av arteriene. Det er derfor vi talsmann bruke parafinolje og la forberedelse hvile i minst 30 min. Av notatet resulterte bruk bufret saltoppløsning i stedet for olje- eller ikke olje hele-i svært variabel diameter og innsnevring av fartøyet (data ikke vist). Videre på slutten av eksperimenter, vi isolert gracilis arteriene - badet i parafinolje - og testet deres reaktivitet i trykk-myograph ex vivo. Parafin olje-badet arteriene reagert på samme måte for å kontrollere arterier når stimulert med insulin og acetylkolin (en vasodilator) (data ikke vist). Den konsekvente insulin-indusert vasodilatasjon viser tydelig at IVM protokollen beskrevet i denne studien gir pålitelige resultater.
Fordelen med å bruke begge teknikkene i samme musen overvinner noen av iboende begrensninger av en teknikk av den andre: CEUS anslår MBV i uforstyrret muskel i vivo, men enkelte skip kan ikke sees; IVM gjør det mulig å se enkelte skip, men det ikke kan beregne MBV. En fremtidig plan er å utnytte IVM mikroskopi av cremaster muskel i kombinasjon med CEUS av adductor muskel på kontralateral side. Denne endringen kan gi anslaget av MBV (med CEUS) og direkte optisk tilgang til kapillærene (med IVM). Protokollen kan endres lenger. 4-veis kontakten for hale kanyle kan bli byttet til en 5-veis kobling. Av dette, kan vi unngå frakobling anestesi røret mens du utfører andre CEUS måling (beskrevet i punkt 2.9). I vår erfaring tolerert musene gjeldende protokollen godt. En annen endring som gjøres til denne protokollen er insulin klemme satsen. Vi brukte 7,5 mU/kg/min klemme sats som anses supra fysiologiske. Avhengig av studien, kan en lavere insulin klemme sats (for eksempel 3 mU/kg/min) brukes.
Vi har funnet beskrevet protokollen pålitelig, finnes det bestemte begrensninger som trenger oppmerksomhet. Det finnes situasjoner når måling av arteriell diameteren ikke er optimal. Utføre de forberedende trinnene krever litt erfaring med modellen. Det er avgjørende at parafinolje ikke lekke fra fartøyet miljøet som supplere det med olje vil forstyrre fartøyet og endre diameter, noe som gjør det nødvendig å la arterien hvile for en annen 30 min. I tillegg var refleksjon av lys (beskrevet i trinn 1.14 protokollen) på overflaten av parafinolje noen ganger for lyse, gjør det vanskelig å se arterien. Dette kan stoppes ved å dirigere lyskilden slik at lyset faller i en vinkel til parafinolje overflate og parallelt arterien.
I konklusjonen, gjør kombinasjonen av IVM og CEUS teknikkene i denne studien det mulig å kvantifisere forskjellige virkninger av insulin på ulike nivåer av er blodkar. IVM av arteria gracilis gir innsikt i oppstrøms vaskulære endringene bidrar til nedstrøms mikrovaskulær perfusjon målt ved hjelp av CEUS. Vi talsmann kombinasjonen av flere eksperimentelle teknikker i samme musen for å bedre vurdere vaskulær funksjonen.

Svar på en økning i blodsukkernivå, bukspyttkjertelen skiller ut insulin i blodet hvor distribueres raskt til sine mål vev som skjelettlidelser muskel, via motstand arterier og kapillærer. Skjelettmuskulatur er ansvarlig for ~ 80% av postprandial glukose opptak1. Levering av insulin til skjelettlidelser muskel interstitium har vist seg å være en rate begrense trinn for metabolske handlinger av insulin som fremmer glukose disposisjon2,3,4. Innen 10-15 min øker insulin kapillær blodvolum (mikrovaskulær rekruttering), en effekt som oppstår før totale blodstrøm øker5,6. Mikrovaskulær rekruttering utvider endothelial areal tilgjengelig for utveksling av næringsstoffer (og insulin)7,8. Insulin-mediert mikrovaskulær rekruttering foran og knyttet uavhengig til endringer i skjelettmuskulatur glukose opptak8,9. Effekten av insulin på er blodkar har blitt kalt 'vaskulær insulinfølsomhet'.
Det har vist at insulin-mediert mikrovaskulær rekruttering og insulin-indusert vasodilatasjon er nedsatt i overvektige Zucker rotter10,11. Videre vise mager mus med redusert kapillær tetthet muskel insulin resistens12. I sitt innflytelsesrike arbeid viste Kubota et al. at svekket insulin signalering i endotelceller forårsaket reduksjon i insulin-indusert mikrovaskulær rekruttering, som redusert glukose opptak i skjelettlidelser muskel med ca 40%13. Disse unormalt i mikrovaskulær funksjonen forekommer ikke bare i muskler, men også i flere andre vev og organer som hjertet, netthinnen og nyre14,15,16. Disse eksemplene og andre studier17,18,19,20 tyder på at vaskulær virkninger av insulin er en viktig mekanisme i (patho) fysiologi av insulinresistens og komplikasjoner.
Mens det er betydelig bevis at insulin øker mikrovaskulær blodvolum (MBV) i skjelettmuskulatur5,6, er mekanismer som dette skjer ikke helt forstått9. Endotelet avhengige av vasodilatasjon er avgjørende i mange aspekter av vaskulær insulin sensitivitet21,22,23 på ulike nivåer av er blodkar. Vaskulær insulinfølsomhet kan manifestere seg av insulin-indusert avslapning av motstand arterier og avslapning av pre kapillær arterioler øke perfused mikrovaskulær exchange areal7,24, 25.
Intravital mikroskopi (IVM) har vært brukt i en rekke vev preparater inkludert skinfold chambers musen dorsum26, mesentery musen og rotten27, modeller av lem iskemi i musen28 og hamster kinnet posen 29. kontrast forbedret ultrasonography (CEUS) er en tenkelig teknikk som gjør at vurdering av blodsirkulasjonen i cardiac30 samt Skjelettmuskel31. Det bruker inert gass fylt microbubbles som fungerer rheologically som røde blodlegemer og fortsatt helt innenfor vaskulære lumen. Disse microbubbles er tilført intravenøst med en konstant hastighet å oppnå en steady-state. En høy energi ultralyd bølge, kan deretter brukes til å ødelegge microbubbles. Microbubbles' etterfylling hastighet i regionen rundt (ROI) representerer flyten hastighet (MFV). Totale signalet intensiteten av kontrast bildet representerer MBV. CEUS kan utføres flere ganger (også i mennesker) og det har avanserte forståelsen av vaskulær dysfunksjon som oppstår i insulin-resistente stater (omtalt i Barrett et al. 32).
I denne studien beskriver vi en ny teknikk for å studere regulering av muskel perfusjon gjennom bruke både IVM og CEUS. Her fokusere vi på insulin's vaskulær handlinger i adductor rommet av mus-hindlimb. Dette rommet er en av de største skjelettlidelser muskelgruppene i musen, aktivere studier av lokale glukose opptak i en representant muskel. Dette rommet er ideelt for IVM som forberedelse og visualisering av arteries er lett tilgjengelig med en standardisert kirurgiske prosedyren28. Dessuten, vår egen gruppe og andre har vist at CEUS kan brukes i denne kupeen33,34.
En fordel med kombinert IVM og CEUS teknikken er muligheten til å vurdere insulin's effekt på de større arterioler (feed eller motstand arteriene) og blodsirkulasjonen (kapillære senger) i samme muskelgruppe. I tillegg gir samtidig anvendelse av de to metodene innsikt i timelige handlingen av insulin på nivåene av motstand arteriene og mikrosirkulasjonen. Dette kombinert IVM og CEUS teknikk kan også implementeres i andre vaskulær biologi-felt. For eksempel kan rollen ulike proteiner og visse patofysiologiske forhold påvirker endotelet studeres med knockout modeller. Dessuten, begge teknikkene kan brukes i en mus på flere tidspunkt å redusere tid og kostnader av forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">C57BL/6 Mice</td>
			<td style="width:251px;">Charles river</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:583px;">Mice used were bred in-house</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS250 non-linear transducer</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vevo 2100 software</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)</td>
			<td>CSP Medical</td>
			<td>133-1009</td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>58815-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heating pad&#160;</td>
			<td>Pantlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle Precision Xceed&#160;</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin Novorapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose monohydrate&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1083421000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffered saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>152118062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-20 medical tubing</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>427405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle, 27 Gauge&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound probe holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Built In-house</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton swabs</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Creme depilator</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Gel tissue adhesive</td>
			<td style="width:251px;">Derma+flex</td>
			<td style="width:136px;">GA30005-2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Infusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2">Harvard Apparatus PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small fine straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Needle holder</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:136px;">12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Straight forceps with fine tip</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:136px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Camera</td>
			<td style="width:251px;">Basler</td>
			<td style="width:136px;">scA1390-17gc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Image Grabber program</td>
			<td style="width:251px;">Built in-house</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Timer</td>
			<td style="width:251px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">33501-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes, 1 ml</td>
			<td style="width:251px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">14-817-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Light source, fiber-optic</td>
			<td style="width:251px;">Schott</td>
			<td style="width:136px;">KL1500</td>
			<td style="width:583px;">Ideally has adjustable arms</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Paraffin oil</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Microbubbles</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyoxyethylene stearate&#160;</td>
			<td style="width:251px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:136px;">p3440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">perfluorobutane gas&#160;</td>
			<td style="width:251px;">F2 Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">C4F10(g)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Decon FS200 ultrasonic bath&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Decon Ultrasonics Ltd</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Vialmix&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:136px;">515370-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography of the mouse hindlimb to study insulin-induced vasodilation and muscle perfusion

Det har blitt demonstrert at insulin's vaskulær handlinger bidra til regulering av insulinfølsomhet. Insulins effekter på muskel perfusjon regulere postprandial levering av næringsstoffer og hormoner til insulin-sensitive vev. Vi her beskriver en teknikk for å kombinere intravital mikroskopi (IVM) og kontrast forbedret ultrasonography (CEUS) adductor kupé av musen hindlimb samtidig visualisere muskel motstand arterier og perfusjon av den mikrosirkulasjonen i vivo. Samtidig vurdere insulin's effekt på flere nivåer av vaskulær treet er viktig å studere forholdet mellom insulin's flere vasoactive effekter og muskel perfusjon. Eksperimenter i denne studien ble utført i mus. Først settes hale blodåre kanyle for tilførsel av anestesi, vasoactive forbindelser og ultralyd kontrast agent (lipid-kapslet microbubbles). Andre er en liten snitt gjort i lysken til utsettes arteriell treet av adductor muskel kupé. Den ultralyd proben er deretter plassert den kontralateral øvre hindlimb vise musklene i tverrsnitt. For å vurdere opprinnelige parametere, arteriell diameter er vurdert og microbubbles er senere tilført ved en konstant hastighet å anslå muskel blodstrømmen og mikrovaskulær blodvolum (MBV). Når brukt før og under en hyperinsulinemic-euglycemic klemme, tillate kombinert IVM og CEUS vurdering av insulin-induserte endringer av arterial diameter, mikrovaskulær muskel perfusjon og hele kroppen insulinfølsomhet. Videre kan timelige forholdet mellom svar av mikrosirkulasjonen og motstand arteries til insulin kvantifiseres. Det er også mulig å følge opp mus langs i klokken, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for å studere endringer i vaskulær og hele kroppen insulinfølsomhet.

Glukose infusjonshastigheten under hyperinsulinemic-euglycemic klemmen (insulinfølsomhet) var 180.21 ± 19.81 µmol/kg/min. lokal anvendelse av parafinolje på den adductor muskel kupé å stabilisere fartøyet endret ikke den gjennomsnittlige planlagte diameteren av arteries (73.6 ± 29.0 µm vs 68.8 ± 17,9 µm; p = 0.58) men hjalp redusere variasjonen dyrene testet (figur 4A). Insulin økte konsekvent gracilis arterien diameter (med 14.58 ± 6,2% 60 minutter; N = 9) som var signifikant forskjellig (p < 0,0001) fra diameter endringen skyldes saltvann infusjon (-6.3 ± 4,9%; N = 6). Insulin-indusert vasodilatasjon var merkbar etter 10 min (10.09 ± 5.1%. p = 0,002) og nådde ca 95% av maksimal dilatory kapasitet etter 30 min.
Bruker CEUS, insulin konsekvent økte muskel MBV (figur 5A) med 33,5% (± 31.04%, N = 7, p = 0.0009) sammenlignet med saltvann infusjon (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (figur 5B). Dataene som presenteres er signalet intensiteten av muskel MBV delt som i femur fartøyer. Dette reduserer eksperimentell variasjoner mellom ulike målinger og mellom ulike mus (data ikke vist). Signalet intensiteten i femur fartøyer tilsvarer lineært konsentrasjonen av microbubbles i sirkulasjon (Figur 3 c). Korrigere for femur fartøyenes signal teoretisk korrigerer for forskjeller i konsentrasjoner av microbubbles brukes (figur 3D). Dataene presenteres i denne delen som betyr ± standardavvik.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> Figur 1: Kirurgisk utredning av Adductor kupé av Hindlimb. (A) et snitt er gjort på lyske, parallell retning av lysken ligament. (B) mild trekkraft på fett puten i distale retninger (svart piler) vil presentere connective vev (*) mellom fett puten og bukveggen. (C) huden kaster av innsnitt kan justeres med bulldog vedholderen opprette et lite hulrom å holde parafinolje som bader fartøyene. (D) ultralyd probe er plassert på den kontralateral øvre hindlimb etter arteria forberedt gracilis åpnes i kalibrert mikroskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> Figur 2: Intravital mikroskopi av musen Hindlimb. Femoral arterien (A) gir opphav til arteria epigastric (B) og gracilis arterien (C) som går adductor muskel gruppen (D). Arteria gracilis brukes til IVM ved hjelp av en kalibrert mikroskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> Figur 3: Signalet intensiteten av kontrast forbedret Ultrasonography i muskel mikrovaskulær blodvolum og femur fartøy. (A) visning av lineære kontrasten imaging modus av digital bildebehandling plattform under microbubbles konstant tilførsel i en mannlig musen øvre hindlimb. Høyre panel: to ROIs er trukket til å representere muskelen MBV og femur fartøyene. Bare den overfladiske delen av adductor muskel rommet er inkludert i Avkastningen signal intensitet reduseres med dybde. Venstre panel: tid intensitet kurve fra muskel MBV ROI. Loddrette linjer representerer ødeleggelsen av microbubbles (MBD) med høy energi bølger. Umiddelbart etter MBD finnes ingen kontrast agent i tenkelig flyet som begynner å fylles med microbubbles gradvis. Etter 10-15 s, er toppen av kontrast ekstrautstyr nådd. (B-D) Etter en stabil signalet var nådd, infusjonshastigheten på 2,5 x 109 bobler/mL ble doblet (5, 10, 20 µL/min). Signalet intensiteten fra muskel MBV (B) og femur fartøy (C) parallelt dobling av microbubble konsentrasjonen i sirkulasjon. (D) rette muskel MBV for femur fartøy signalet fjerner variasjon i signal intensitet forårsaket av ulike microbubble konsentrasjoner (N = 9; feilfelt representerer standardavvik). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> Figur 4: Intravital mikroskopi målinger av arteria Gracilis. (A) parafinolje reduserer variasjonen av gracilis arteriene av forskjellige dyr (som 29.0 µm uten parafin vs 17,9 µm etter at oljen) mens den gjennomsnittlige planlagte diameteren stabil (73.6 µm vs 68.8 µm; p = 0.58). (B) Arterial diameter ved baseline og etter 60 min av insulin eller saltvann infusjoner. Insulin etter 60 min infusjon konsekvent utvidet arteria gracilis (p < 0,0001) sammenlignet med saltvann infusjon. (C) Insulin-indusert vasodilatasjon skjer i 10 min etter starten av infusjonen (p = 0,002) og når 95% av maksimalt på 30 min. feilfelt representerer standardavvik; kort Student T-test brukes for statistikk. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> Figur 5: Mikrovaskulær blod volum mål med kontrast forbedret Ultrasonography av Adductor muskel kupé av musen Hindlimb. (A) Insulin resulterte i en jevn økning i MBV 30 min etter starten av insulin infusjon. (B) forskjellen mellom hyperinsulinemic og Grunnmålingene (MBV endre) er merket som insulin-mediert mikrovaskulær rekruttering. Insulin indusert en 33,5% (± 31.04%, p = 0.016; N = 7) mikrovaskulær rekruttering sammenlignet med saltvann infusjon (-10.63 ± 27.87%, N = 6). Feilfelt representerer standardavvik; kort Student T-test brukes for statistikk. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion at JoVE.

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Insulin-indusert vasodilatasjon regulerer muskel perfusjon og øker den mikrovaskulær overflaten området (mikrovaskulær rekruttering) tilgjengelig for stoff utveksling mellom blod og vev interstitium. Kombinert intravital mikroskopi og kontrast forbedret ultrasonography er presentert for samtidig vurdere insulin's aksjon på større fartøy og blodsirkulasjonen i vivo.

Kombinert Intravital mikroskopi og kontrast forbedret Ultrasonography av mus-Hindlimb for å studere Insulin-indusert vasodilatasjon og muskel perfusjon

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Contrast Enhanced Vessel Imaging using MicroCT

Microscopic computed tomography (microCT) offers high-resolution volumetric imaging of the anatomy of living small animals. However, the contrast between ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

Noninvasive røret Intubering å studere patologi og fysiologi av Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En orthotopic Glioblastoma Mouse Model Opprettholde Brain Parenkymalt fysiske begrensninger og Egnet for Intravital To-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic Contrast Forbedret Magnetic Resonance Imaging av en ortotopiske Bukspyttkjertelkreft Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intramikroskopi og Trombevekten Induksjon i øreflippen av en naken Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Evaluering av de mekaniske og viskoelastiske egenskapene til rotte tungen

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

Ultrasonography i eksperimentell reproduktive undersøkelser på rotter

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Observasjonelle studier protokollen for gjentatte klinisk eksamen og kritiske omsorg Ultrasonography innen enkel intensivavdelinger studier

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...