Name: combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography of the mouse hindlimb to study insulin-induced vasodilation and muscle perfusion
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion at JoVE.

Vi tackar Ing. Duncan van Groen för programmering analys bildbehandlingsprogram (ImageGrabber) används i denna studie. Finansieringen av denna forskning har lämnats av ett VIDI bidrag från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (grant 016.136.372).

Alla djurförsök har godkänts av den lokala djurens vård och etiska kommittén. Hela protokollet från induktion av anestesi i musen fram till slutet av hyperinsulinemic-euglycemic klämman tar ca 2 h.
1. mikrokirurgisk förberedelse
<ol><li>Inducera anestesi tillsammans med analgesi i en manlig mus väger 20-25 g efter en 14 timmar eller över natten fastan med en intraperitoneal injektion av Fentanyl (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) och Acepromazin (6,25 mg/kg) (FMA anestesi) och placera den på en rektal-temperatur-kontrollerad homeothermic värmedyna som upprätthåller kroppstemperatur på 37 ° C.</li>
	<li>Desinficera tabellen drift och utrustning flera gånger med en alkohol-baserad lösning.</li>
	<li>Bifoga en 27 G nål till en 10 cm lång polyeten rör (PE-20) och fäst röret till en 4-vägs kontakt. Stick in nålen i svansen venen och fixera den med vävnad självhäftande gel. Denna kanyl används för infusion av mikrobubblor, insulin, glukos och anestesi. Obs: Lägga till Heparin (5 U/mL) i steril koksaltlösning under kanylering processen att spola svans venen (ca 10 µL) minskar risken för tilltäppta kanyler.</li>
	<li>Hela den kirurgiska ingrepp och experimentella protokoll, underhålla anestesi av en kontinuerlig intravenös infusion av FMA anestesi via svans ven kanylen hastighet av 33.75 µL/kg/min.</li>
	<li>Placera musen med den ventral Sidan upp och fixa fötterna med en termostabila tejp för att exponera övre låret. Använda en liten exorotation av höftleden (bakbenet tassar uppåt) och en 40-60° vinkel i knäleden för att standardisera sträckan av muskeln på adductor facket av låret.</li>
	<li>Ta bort hår vid ljumsken och övre låret områden bilateralt med hjälp av en hårborttagningsprodukter kräm. Samla allt löst hår med en fuktig bomullstuss.</li>
	<li>Placera musen under ett stereomikroskop och utför följande kirurgiska steg med 10 X till 16 X förstoring.</li>
	<li>Gör en 2 cm snitt med huden sax löper parallellt med inguinal ligament, bara i sidled till buken krökning (figur 1). Tillämpa dragkraft på distala sida av snittet distalt använda en bulldog klämma (figur 1 d). Detta hjälper till att justera fönstret efter behov och hjälpa hålla paraffinolja (beskrivs i 1.12).</li>
	<li>Dissekera fettvävnaden från bukväggen. För att undvika blödning, försiktigt separera fettet pad från väggen i stället för dissekera direkt via pad. Mild dragkraft på fettet pad i distal riktning kommer att underlätta processen (figur 1 c).</li>
	<li>Identifiera femoralisartären och följa den ner till den första stora grenar (epigastrisk artären och gracilis artär) (figur 2). Den gracilis artären är den första största grenen av femoralartären körs på adductor magnus muskeln och sedan körs djupt till gracilis muskeln. Gracilis artären kommer att användas för IVM.</li>
	<li>Identifiera den transparenta djupa fascian som täcker musklerna och fartyg. Använda vass tång, dra fascian uppåt och skär den med en microscissor.</li>
	<li>Täcka de utsatta muskler med en droppe (200 µL) av läkemedel flytande paraffin (rumstemperatur eller pre värmas till 37 ° C) att förhindra beredda vävnaden från att torka ut. Kontrollera att oljan droppa inte läcker bort. Justera hudveck av snittet med bulldog klämman för att skapa en liten hålighet för att hålla den paraffinolja som badar fartygen.</li>
	<li>Placera musen i tidigare kalibrerade Mikroskop (16 X optisk förstoring) på ett sådant sätt att den gracilis artären är vertikala på datorskärmen. Bifoga mikroskopet till en kamera och dator baserat analyssystem som kan extrahera fartygens diameter från bilden datauppsättningen. Diametern är avståndet mellan de två luminala sidorna av fartyget. Kontinuerlig övervakning och mätning av artär diameter är önskvärt.</li>
	<li>Placera ljuskällan på tillräckligt avstånd (minst 20 cm) från det bakbenet att minska huvud överledning från ljuset.</li>
	<li>Gälla det övre kontralaterala bakbenet förvärmd ultraljud transduktion gel. Placera ultraljud sonden vinkelrätt mot den långa axeln av lårbenet ben.</li>
	<li>Noggrant justera vinkel och riktning av ultraljud sonden att få en tvärsnittsvyn i gruppen adductor muskel. Var noga med för att hålla positionen för ultraljud sonden i förhållande till musen stabilt att hålla samma imaging planet för baslinjen och hyperinsulinemic mätningar.</li>
	<li>Låt musen stabilisera för 30 min. Diametern på den gracilis artären bör vara stabila i 10 min innan dokumentera baslinjen diameter.</li>
</ol>2. baslinjen och Hyperinsulinemic mätningar
<ol><li>Kontrollera att baslinjen gracilis artär diameter sparas av det datorprogram som används för IVM.</li>
	<li>Förbereda mikrobubblor i förväg som beskrivs35 och räkna med Coulter strider mot en koncentration av 2,5 x 109 bubblor/mL strax innan experimentet.</li>
	<li>
Som mikrobubblor kan endast ses i kontrast-läget av ultraljudsmaskinen, kontrollera de parametrar som påverkar bilden och kontrast insamlade (beskrivs i 2.3.1) och användning konsekvent under förvärv.
	<ol>
<li>Använd följande inställningar på ultraljudsmaskinen: kontrast vinst på 35 decibel; tiden få ersättning på OFF; Line densitet till hög; Antal fokal zoner till WIDE; Överföra makten till 4%. Överföra strålbredd till STANDARD; SV Gate 4; Känslighet för 1; Uthållighet på OFF. Nivå platsen för Focal zoner till centrera av regionen av intresse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spara en kort (5 s) klipp. Detta kommer att användas för att beräkna den bakgrund signalen.</li>
	<li>Skaka injektionsflaskan med den mikrobubblor för hand för att ha en homogen suspension. Starta infusion av mikrobubblor som använder svans ven kanylen med en 5 µL/min hastighet. Placera infusion röret på en vibrerande virvel (200 x per minut) för att upprätthålla en enhetlig suspension av mikrobubblor.</li>
	<li>Låt 5 minuter av kontinuerlig infusion av mikrobubblor så att en steady state-nivån uppnås. Fortsätt med att få den tid-intensitet kurvor av bubblor med hjälp av funktionen mikrobubblor destruct (MBD) på ultraljudsmaskinen på 5 min och 10 min efter starten av mikrobubblor infusion (figur 3A). Ta den genomsnittliga signalen av dessa två mätningar att få baslinjen perfusion data.</li>
	<li>
Efter att få börja baslinje data, hyperinsulinemic-euglycemic klämman som beskrivs34. Använda svans kanylen (placeras i 1.3) att administrera insulin och glukos (och anestesi).
	<ol>
<li>Kort sagt, framkalla ett hyperinsulinemic tillstånd genom att införa en insulin från 200 ME/kg, följt av kontinuerlig insulin infusion (7,5 ME/kg/min) för 60 min. Använd en variabel infusion av 20% D-glukos för att bibehålla euglycemia.</li>
		<li>Bedöma blodsockret från svans venen varje 5 min med en glukos övervakning anordning och underhålla på 5 mM genom att justera variabel glukos infusionshastigheten. Bestämma insulinkänslighet genom genomsnitt genomsnittliga glukos infusionshastigheten under de sista 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se till att diametern på gracilis artären är dokumenterad på önskad perioderna (till exempel på 10, 30 eller 60 min) i början av hyperinsulinemic-euglycemic klämman med datorprogrammet.</li>
	<li>Efter 25 min och/eller 55 min av insulin klämman, starta den andra (hyperinsulinemic) CEUS mätningen för att dokumentera MBV på 30 eller 60 min, respektive. Följ samma steg beskrivs i 2.4 och 2.5. Lossa och använda anestesi porten av 4-vägs kontakt för att ingjuta mikrobubblor. Återanslut anestesi röret efter slutet av mikrobubblor infusionen.</li>
	<li>Efter slutförandet av IVM och CEUS mätningar 60 min efter start av insulin infusion, dra tillbaka blod från musen genom hjärtat punktering förfarande för senare analys. Detta kommer också att avliva musen. Noggrant dissekera den gracilis och femoral artärer och lagra dem för ytterligare önskade experiment (för t.ex., Western blotting, immunohistokemi, ex vivo trycket myography experiment36,37, 38).</li>
</ol>3. offline analys

Obs: Analyser av IVM och CEUS mätningar ska utföras offline av en blindad utredare. CEUS erbjuder möjligheten att skilja mikrocirkulationen från större fartyg av tillfälligt förstörs mikrobubblor av hög intensitet ultraljudsvågor med funktionen MBD. Signalen (mätt i godtyckliga enheter (Assarsson)) i större fartyg återställs snabbare än i mikrocirkulationen för mikrobubblor hastigheten i de motsvarande fartyg.
<ol><li>Använda en offline arbetsstation eller programvaran ultraljudsmaskinen för att göra analyser.</li>
	<li>Rita en region av intressen (ROI) för att inkludera mikrocirkulationen. Rita en separat ROI att omfatta större femorala fartyg (figur 3A).</li>
	<li>Duplicera den mikrocirkulationens och större fartygens ROIs för bakgrund, baslinjen och hyperinsulinemic mätningar med hjälp av funktionen ROI kopia byggd i programvaran.</li>
	<li>Subtrahera intensitet signalen bakgrund mätningen från baslinjen och hyperinsulinemic mätningar.</li>
	<li>Dela upp intensiteten signalen av mikrocirkulationen av intensitet signalen av femorala fartyg. Baslinjen och hyperinsulinemic MBVs kan nu jämföras.</li>
</ol>

Visuella Sonics Inc. omfattas öppna avgifter, medan strukturen och innehållet i artikel förblivit det fulla ansvaret för författarna.

Vi har utvecklat en teknik för att samtidigt uppskatta insulinets vaskulär åtgärder på större artärer (med IVM) och skelettmuskel mikrocirkulationen (med CEUS). De kritiska steg för lyckad och pålitliga mätningar är: 1) korrekt exponera gracilis artären utan blödning; (2) att förhindra läckage av paraffinolja bad artären; (3) att ha en patent venkateter (svans ven kanyl) för infusion av vasoaktiva substanser (insulin) och kontrastmedel (mikrobubblor).
Studien av mikrovaskulära dysfunktion i muskler har få uppmärksamhet i samband med fetma och insulin resistens14,25,39,40. De negativa effekterna av fetma och insulinresistens på vaskulär funktion manifesteras på olika nivåer i vaskulär trädet. Hädanefter, krävs olika synsätt för att bedöma dessa förändringar. Den kombinerade användningen av IVM och CEUS tekniker i samma mus ger ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera insulinets effekter på olika nivåer i kärlsystemet. IVM tillåter direkt visualisering och kvantitativ analys av motstånd artär och CEUS tillåter bedömning av insulin-inducerade förändringar i muskeln perfusion.
Studera i adductor muskel facket har flera fördelar. Artärerna är lättillgänglig och ytliga natur av snittet gör det möjligt att stänga huden snitt med en 5,0 Resorberbara sterila suturen efter experimentet är klar. Djuren var injiceras subkutant med buprenorfin efter experimenten som smärtstillande medel vid en dos på 0,1 mg/kg och får återhämta sig i en varm miljö. Mössen tolereras förfarandet mycket väl och vi upplevde ingen förlust av djur eller infektioner i bakbenet i mer än 35 djur studeras. Detta gör det möjligt att följa upp eller studera djuren i en längsgående mode. De djur som används i dessa experiment, var dock bedövas med 1,8% inhaleras isofluran balanserad med syre flyter på 0,4 L/min dock en anestesi-mask. I motsats till isofluran anestesi41,42stör inte FMA anestesi perifer insulinkänslighet. En framtida plan är att studera hur väl mössen återhämta sig från FMA anestesi.
Adductor muskel facket är också användbart sedan olika vasoaktiva substanser medla lokala och nedströms kärleffekter kan utvärderas. Till exempel är topikal applicering av dessa föreningar till målvävnaden möjligt med hjälp av superfusion tekniker28 eller kirurgisk manipulation och implantation av drogen-eluering muddar kring fartyg43. Gracilis artären kan dessutom isoleras och studerade i den trycket myograph. Vår grupp och andra har samlat betydande experimentella bevis använder den trycket myograph för att dokumentera effekterna av insulin och andra vasoaktiva substanser på denna artär ex vivo36,37,38.
En begränsning som inneboende till användningen av tekniken med IVM är kirurgiska utläggningen av muskeln och tillämpning av paraffinolja att stabilisera fartygen. Det är oklart huruvida dessa åtgärder påverkar den ursprungliga miljön av artären. Figur 3A visar dock att baslinjen diametern av gracilis artär badar i paraffinolja inte förändras avsevärt. Det har också visat att mineralolja framgångsrikt hämmar spridningen av syre, skydda vävnaden från hyperoxic villkor44. Dessutom oljan hjälper till att minska variationen i baslinjen diametern av artärerna. Det är därför vi förespråkar att använda paraffinolja och låt förberedelse vila minst 30 min. Notera resulterade användningen av buffrad saltlösning istället för olja – eller ingen olja alls – i mycket varierande diametrar och sammandragning av fartyget (inga data anges). Dessutom i slutet av experimenten, vi isolerade gracilis artärerna - badade i paraffinolja - och testade deras reaktivitet i den trycket myograph ex vivo. Paraffin olja-badade artärerna reagerade på samma sätt för att styra artärer när stimuleras med insulin och acetylkolin (en vasodilator) (inga data anges). Den konsekventa insulin-inducerad vasodilatation visar tydligt att det IVM-protokollet som beskrivs i denna studie ger tillförlitliga resultat.
Fördelen med tillämpa båda tekniker i samma mus övervinner några av de inneboende begränsningarna av en teknik av den andra: CEUS uppskattar MBV i den ostörda muskel in vivo men enskilda fartyg inte kan ses; IVM gör det möjligt att se enskilda fartyg, om än det inte kan uppskatta MBV. En framtida plan är att utnyttja IVM mikroskopi av cremaster muskeln i kombination med CEUS av adductor muskeln på den kontralaterala sidan. Denna ändring kan ge en uppskattning av den MBV (med CEUS) och en optisk direktåtkomst till kapillärerna (med IVM). Protokollet kan ändras ytterligare; 4-vägs kontakten som används för svans kanylen kan kopplas till en 5-vägs kontakt. Av detta, kan vi undvika demontering anestesi röret medan du utför andra CEUS mätningen (beskrivs i punkt 2.9). I vår erfarenhet tolereras mössen det nuvarande protokollet väl. En annan ändring som kan göras till detta protokoll är den insulin klämma som används. Vi använde 7,5 ME/kg/min klämma ränta som anses suprafysiologiska. Beroende på studien, kan lägre insulin klämma ränta (till exempel 3 mU/kg/min) användas.
Medan vi har hittat protokollet beskrivs tillförlitlig, finns det särskilda begränsningar som behöver uppmärksamhet. Det finns situationer när mätningen av arteriell diametern inte är optimal. Exekvera förberedelsesteg kräver viss erfarenhet med modellen. Det är avgörande att paraffinolja inte läcker från fartyget miljön som komplettera den med ny olja kommer att störa fartyget och ändra diameter, vilket gör det nödvändigt att låta artär resten för en annan 30 min. Reflektion av ljuset (som beskrivs i steg 1.14 i protokollet) på ytan av paraffinolja var dessutom ibland för ljus, vilket gör det svårt att Visa artären. Detta kan motverkas genom att rikta ljuskällan så att ljuset faller i en vinkel till paraffinolja ytan och parallel till artären.
Sammanfattningsvis, gör kombinationen av IVM och CEUS tekniker som beskrivs i denna studie det möjligt att kvantifiera olika effekter av insulin på olika nivåer i kärlsystemet. IVM gracilis artären ger inblick i de uppströms vaskulära förändringar bidrar till nedströms mikrovaskulära perfusion mätt med CEUS. Vi förespråkar en kombination av flera experimentella tekniker i samma musen för att bättre bedöma vaskulär funktion.

Svar på en ökning av blodsockernivå utsöndrar bukspottkörteln insulin i blodomloppet där det distribueras snabbt till dess målvävnader såsom skelettmuskulatur, via motstånd artärer och kapillärer. Skelettmuskulaturen är ansvarig för ~ 80% av postprandiella upptag1. Leverans av insulin till den skelettmuskulaturen interstitium har visat sig vara ett hastighetsbestämmande steget för metabola åtgärder av insulin som främjar glukos förfogande2,3,4. Insulin ökar inom 10-15 min, den kapillär blodvolymen (mikrovaskulära rekrytering), en effekt som uppstår innan totalt blodflödet ökar5,6. Mikrovaskulära rekrytering utökar endothelial yta tillgänglig för utbyte av näringsämnen (och insulin)7,8. Insulin-medierad mikrovaskulära rekrytering föregår och är självständigt associerade med förändringar i skelettmuskulaturen glukos upptag8,9. Effekten av insulin på vaskulatur har kallats 'vaskulär insulinkänslighet'.
Det har visats att insulin-medierad mikrovaskulära rekrytering och insulin-inducerad vasodilatation är nedsatt hos överviktiga Zucker råttor10,11. Dessutom visar lean möss med nedsatt kapillär densitet muskel insulin resistens12. I sin inflytelserika arbete visade Kubota et al. att nedsatt insulin signalering i endotelceller orsakade minskad insulin-inducerad mikrovaskulära rekrytering, som minskat glukosupptag i skelettmuskulatur med cirka 40%13. Dessa abnormiteter i mikrovaskulära funktion förekommer inte bara i muskler, men också i flera andra vävnader och organ såsom hjärtat, näthinnan och njure14,15,16. Dessa exempel och andra studier17,18,19,20 tyder på att vaskulära effekter av insulin är en viktig mekanism i insulinresistens (patolo) fysiologi och dess komplikationer.
Medan det finns påtagliga bevis för att insulin ökar mikrovaskulära blodvolym (MBV) i skelettmuskulaturen5,6, är de mekanismer genom vilka detta händer inte helt förstått9. Endotel-beroende vasodilatation är viktigt i många aspekter av vaskulär insulin känsligheten21,22,23 på olika nivåer i kärlsystemet. Vaskulär insulinkänslighet kan manifestera sig genom insulin-inducerad avkoppling av motstånd artärer och uppmjukning av pre kapillär arterioler att öka den perfunderade mikrovaskulära exchange yta7,24, 25.
Intravital mikroskopi (IVM) har använts i en mängd vävnad preparat inklusive skinfold chambers mus dorsum26, tarmkäx mus och råtta27, modeller av lem ischemi i mus28 och hamster kinden påsen 29. kontrastförstärkt ultraljud (CEUS) är en annan bildteknik som möjliggör bedömning av mikrocirkulationen i hjärt30 samt skelettmuskulaturen31. Det använder inert gas-filled mikrobubblor som beter sig rheologically som röda blodkroppar och förblir helt inom vaskulär lumen. Dessa mikrobubblor infunderas intravenöst med en konstant hastighet att uppnå steady-state. En hög energi ultraljud våg, kan sedan användas för att förstöra mikrobubblor. Den mikrobubblor påfyllning hastigheten i regionen av intresse (ROI) representerar strömningshastighet (MFV). Den totala signalintensitet av kontrast bilden representerar MBV. CEUS kan utföras flera gånger (även i människor) och det har avancerade förståelsen av vaskulär dysfunktion som uppstår i insulinresistenta staterna (diskuteras i Barrett o.a. ( 32).
I den aktuella studien beskriver vi en ny teknik för att studera regleringen av muskel perfusion, genom simultan användning av både IVM och CEUS. Här fokuserar vi på insulinets vaskulär åtgärder i adductor facket av mus bakbenet. Detta fack är en av de största skelettmuskulatur grupperna i musen, möjliggör studier av lokala glukosupptag i en representativ muskel. Kupén är idealisk för IVM som förberedelse och visualisering av artärerna är lättåtkomligt genom en standardiserad kirurgiskt ingrepp28. Dessutom har våra egna gruppen och andra visat att CEUS kan användas i detta fack33,34.
En fördel med den kombinera IVM och CEUS tekniken är möjligheten att bedöma insulinets effekt på nivån av de större arterioler (foder eller motstånd artärer) och mikrocirkulationen (kapillära bäddar) i på samma muskelgrupp. Dessutom, ger den samtidiga tillämpningen av de två metoderna inblick i den tidsmässiga effekten av insulin på nivåer av motstånd artärer och mikrocirkulation. Denna kombinerade IVM och CEUS teknik kan också genomföras i andra vaskulärbiologi fält. Exempelvis kan olika proteiner och vissa patofysiologiska förhållanden som påverkar endotelet roll studeras med hjälp av knockout modeller. Båda teknikerna kan dessutom användas i en mus vid flera tidpunkter att minska tiden och kostnaden för forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">C57BL/6 Mice</td>
			<td style="width:251px;">Charles river</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:583px;">Mice used were bred in-house</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS250 non-linear transducer</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vevo 2100 software</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)</td>
			<td>CSP Medical</td>
			<td>133-1009</td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>58815-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heating pad&#160;</td>
			<td>Pantlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle Precision Xceed&#160;</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin Novorapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose monohydrate&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1083421000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffered saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>152118062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-20 medical tubing</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>427405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle, 27 Gauge&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound probe holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Built In-house</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton swabs</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Creme depilator</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Gel tissue adhesive</td>
			<td style="width:251px;">Derma+flex</td>
			<td style="width:136px;">GA30005-2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Infusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2">Harvard Apparatus PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small fine straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Needle holder</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:136px;">12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Straight forceps with fine tip</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:136px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Camera</td>
			<td style="width:251px;">Basler</td>
			<td style="width:136px;">scA1390-17gc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Image Grabber program</td>
			<td style="width:251px;">Built in-house</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Timer</td>
			<td style="width:251px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">33501-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes, 1 ml</td>
			<td style="width:251px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">14-817-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Light source, fiber-optic</td>
			<td style="width:251px;">Schott</td>
			<td style="width:136px;">KL1500</td>
			<td style="width:583px;">Ideally has adjustable arms</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Paraffin oil</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Multiple Equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Microbubbles</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyoxyethylene stearate&#160;</td>
			<td style="width:251px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:136px;">p3440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">perfluorobutane gas&#160;</td>
			<td style="width:251px;">F2 Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">C4F10(g)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Decon FS200 ultrasonic bath&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Decon Ultrasonics Ltd</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Vialmix&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:136px;">515370-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography of the mouse hindlimb to study insulin-induced vasodilation and muscle perfusion

Det har visats att insulinets vaskulär åtgärder bidrar till regleringen av insulinkänslighet. Insulinets effekter på muskel perfusion reglera postprandial leverans av näringsämnen och hormoner till insulin-känsliga vävnader. Vi här beskriver en teknik för att kombinera intravital mikroskopi (IVM) och kontrastförstärkt ultraljud (CEUS) av adductor facket av mus bakbenet samtidigt visualisera muskel motstånd artärer och genomblödning av den mikrocirkulationen invivo. Samtidigt bedömer insulinets effekt på flera olika nivåer av vaskulär träd är viktigt att studera relationer mellan insulinets flera vasoaktiva effekter och muskel perfusion. Experimenten i denna studie utfördes på möss. Först, svans ven kanylen sätts för infusion av anestesi, vasoaktiva substanser och kontrastmedel för ultraljud (lipid-inkapslat mikrobubblor). Det andra görs ett litet snitt i ljumskarna att exponera arteriell trädet av adductor muskel facket. Ultraljud sonden placeras sedan på det kontralaterala övre bakbenet att Visa musklerna i tvärsnitt. För att bedöma baslinjen parametrar, arteriell diameter bedöms och mikrobubblor infunderas därefter med en konstant hastighet att uppskatta muskel blodflödet och mikrovaskulära blodvolym (MBV). När den appliceras före och under en hyperinsulinemic-euglycemic-klämma, tillåter kombinerade IVM och CEUS bedömning av insulin-inducerad ändringar av arteriell diameter, mikrovaskulära muskel perfusion och hela kroppen insulinkänsligheten. Dessutom kan tidsmässiga förhållandet mellan svaren av mikrocirkulationen och motstånd artärerna till insulin kvantifieras. Det är också möjligt att följa upp möss längdriktningen i tiden, vilket gör det ett värdefullt verktyg för att studera förändringar i vaskulär och hela kroppen insulinkänsligheten.

Glukos infusionshastigheten under den hyperinsulinemic-euglycemic klämman (insulinkänslighet) var 180.21 ± 19,81 µmol/kg/min. lokala tillämpningen av paraffinolja på adductor muskel fack att stabilisera fartyget förändrades inte den genomsnittliga baslinje diametern i artärer (73,6 ± 29,0 µm vs. 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58) men djuren bidragit till att minska variationen och testade (figur 4A). Insulin ökade konsekvent gracilis artär diameter (14.58 ± 6.2% vid 60 min; N = 9) vilket var signifikant (p < 0,0001) från diameter ändringen orsakas av saltlösning infusion (-6,3 ± 4,9%; N = 6). Insulin-inducerad vasodilatation var märkbar efter 10 min (10.09 ± 5,1%; p = 0,002) och nådde cirka 95% av sin maximala förhalande kapacitet efter 30 min.
Använda CEUS, insulin konsekvent ökade muskel MBV (figur 5A) 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0.0009) jämfört med saltlösning infusion (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (figur 5B). De uppgifter som presenteras är signal stödnivåerna muskeln MBV dividerat med som i femorala fartyg. Detta minskar experimentell variation mellan olika mätningar och mellan olika möss (inga data anges). Signal intensiteten i femorala fartyg motsvarar linjärt med koncentrationen av mikrobubblor i cirkulationen (figur 3 c). Korrigering för femorala fartyg signal teoretiskt korrigerar för skillnader i koncentrationer av mikrobubblor används (figur 3D). Data presenteras i detta avsnitt som medelvärde ± standardavvikelse.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> Figur 1: Kirurgiska Exposition av Adductor facket av bakbenet. (A) ett snitt i ljumsken, parallellt med riktningen av inguinal ligament. (B) mild dragkraft på fettet pad i distal riktning (svarta pilar) kommer att presentera det connective silkespappret (*) mellan fettet pad och bukväggen. (C), huden veck av snittet kan justeras med bulldog klämman för att skapa en liten hålighet för att hålla den paraffinolja som badar fartygen. (D), ultraljud sonden är placerad på det kontralaterala övre bakbenet efter den beredda gracilis artären har visats med kalibrerad Mikroskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> Figur 2: Intravital mikroskopi av mus bakbenet. Femoralisartären (A) ger upphov till epigastrisk artären (B) och gracilis artär (C) som löper över den adductor muskelgrupp (D). Gracilis artären används för IVM med kalibrerad Mikroskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> Figur 3: Signal intensiteten av kontrastförstärkt ultraljud i muskel mikrovaskulära blodvolym och femorala fartyg. (A) vy av ickelinjära kontrasten imaging läge av digital tänkbar plattformen under mikrobubblor konstant infusion i en manlig musen övre bakbenet. Högra panelen: två ROIs dras för att representera muskeln MBV och femorala fartyg. Bara den ytliga delen av adductor muskel facket ingår i ROI som signal intensitet minskar med djupet. Vänstra panelen: tid-intensitet kurva från muskeln MBV ROI. Vertikala linjer representerar förstörelsen av mikrobubblor (MBD) med hög energi vågor. Omedelbart efter MBD finns inga kontrastmedel i imaging planet som börjar att fylla med mikrobubblor gradvis. Efter 10-15 s, har toppen av kontrastförbättring uppnåtts. (B-D) Efter en steady state-signal nåddes, infusionshastigheten för 2,5 x 109 bubblor/mL dubblerades (5, 10, 20 µL/min). Signalintensitet från muskel MBV (B) och femorala fartyg (C) parallellt en fördubbling av koncentrationen av mikrobubblor i cirkulationen. (D) korrigera muskel MBV för femorala fartyg signalen tar bort variationen i signalintensitet orsakas av olika orien koncentrationer (N = 9;-felstaplar representera standardavvikelsen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> Figur 4: Intravital mikroskopi mätningar av Gracilis artär. (A) paraffinolja minskar variationen av gracilis artärerna i olika djur (som är 29,0 µm utan paraffin vs 17,9 µm efter applicering oljan) samtidigt som den genomsnittliga baslinje diametern stabil (73,6 µm vs. 68,8 µm; p = 0,58). (B) arteriell diametrar vid baseline och efter 60 min insulin eller saltlösning infusioner. Insulin efter infusion 60 min konsekvent vidgade gracilis artären (p < 0,0001) jämfört med saltlösning infusion. (C) Insulin-inducerad vasodilatation uppstår vid 10 min efter start av infusionen (p = 0,002) och når 95% av maximat på 30 min. felstaplar representerar standardavvikelse; oparade Students T-test används för statistik. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> Figur 5: Mikrovaskulära blod volym mätningar med kontrastförstärkt ultraljud av Adductor muskel facket av det mus bakbenet. (A) Insulin resulterade i en konsekvent ökning MBV 30 min efter starten av insulin infusion. (B), skillnaden mellan hyperinsulinemic och baslinjen mätningarna (MBV förändring) betecknas som insulin-medierad mikrovaskulära rekrytering. Insulin inducerade en 33,5% (± 31.04%, p = 0,016; N = 7) mikrovaskulära rekrytering jämfört med saltlösning infusion (-10.63 ± 27.87%, N = 6). Fel-staplarna representerar standardavvikelse; oparade Students T-test används för statistik. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion at JoVE.

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Insulin-inducerad vasodilatation reglerar muskel perfusion och ökar de mikrovaskulära yta (mikrovaskulära rekrytering) tillgängliga för lösningens utbyte mellan blod och vävnad interstitium. Kombinerade intravital mikroskopi och kontrastförstärkt ultraljud presenteras för att samtidigt bedöma insulinets åtgärder på de större fartygen och mikrocirkulationen invivo.

Kombinerade Intravital mikroskopi och kontrastförstärkt ultraljud av mus bakbenet för att studera Insulin-inducerad vasodilatation och muskel Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Contrast Enhanced Vessel Imaging using MicroCT

Contrast Enhanced Vessel avbildning med MicroCT

Microscopic computed tomography (microCT) offers high-resolution volumetric imaging of the anatomy of living small animals. However, the contrast between ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

Noninvasiv Intratrakeal Intubation att studera patologi och fysiologi Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En Orthotopic Glioblastoma musmodell Underhålla hjärnan parenkymal fysiska begränsningar och Passar Intravital Två-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamisk kontrast Förbättrad Magnetic Resonance Imaging av en Orthotopic bukspottkörtelcancer musmodell

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital mikroskopi och trombos induktion i örsnibben av en hårlös mus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo- utvärdering av råtttavans mekaniska och viskoelastiska egenskaper

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

Ultraljud i experimentella reproduktionstoxikologiska undersökningar på råttor

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Observationsstudie protokoll för upprepad klinisk undersökning och kritiska hand ultraljud inom enkla intensivvård studierna

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...