Name: sub-nanometer resolution imaging with amplitude-modulation atomic force microscopy in liquid
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00
Duration: 10 min 25 s
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Die Finanzierung aus der Engineering and Physical Sciences Research Council (Zuschüsse 1452230 und EP / M023915 / 1), der Biotechnologie und Biologische Science Research Council (gewähren BB / M024830 / 1) und der Europäische Rat (FP7 CIG 631186) anerkannt werden dankbar.

1. Reinigung der Werkzeuge und andere Oberflächen HINWEIS: Wenn für Hochauflösung Ziel kann jede Form der Kontamination schädlichen Folgen haben. Es ist daher notwendig, alle Werkzeuge, um sicherzustellen, verwendet die Probe, Substrat oder AFM-Spitzen zu manipulieren gründlich gereinigt. Folgendes gilt für jede Oberfläche oder Instrument (beispielsweise einer Pinzette) , die mit der Probe, Kragarm oder AFM - Zelle, einschließlich der Probenstufe selbst in Berührung kommen können. <ol><li> Bade beschallen die Instrumente in Reinstwasser (18,2 MOhm, &lt;5 ppm organics), gefolgt von Isopropanol (99,7% Reinheit), gefolgt von erneut Reinstwasser für je 10 min. Wenn möglich, verwenden Sie Isopropanol unter einer Abzugshaube Einatmen von Dämpfen zu reduzieren. </li><li> Trocken unter einem Stickstoffstrom. </li><li> Wenn vollständige Eintauchen ist nicht möglich (zB für Cantileverhalters / Elektronik), körperlich sauber die Oberfläche durch Abwischen mit einlagigen, fusselarme Gewebe (light-duty Gewebe Wischer) getränkt in ultrapure Wasser, Isopropanol und Reinstwasser, der Reihe nach. Lassen Sie die Oberfläche in Luft trocknen (in der Regel innerhalb von 15 bis 30 min). </li></ol> 2. Untergrundvorbereitung HINWEIS: Das Substrat bezeichnet die feste Oberfläche die Proben direkt unterstützen, die typischerweise in physischem Kontakt sowohl mit der AFM-Scanner und der Probe. Die meisten AFMs haben eine Magnethalterung und Stahlplatten verwendet werden können, aber das gleiche Protokoll ist für Substrate wie Glas-Folien geeignet. Hier gehen wir von einer Stahlplatte, auf der eine Glimmerscheibe befestigt ist. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, so viel wie möglich, externe Kontaminationsquellen zu begrenzen, die die Abbildungs ​​beeinflussen können. Handschuhe müssen jederzeit getragen werden. <ol><li> Bade beschallen die Stahlprobenscheibe in Reinstwasser (18,2 M &amp; OHgr;), gefolgt von Isopropanol und schließlich Reinstwasser wieder, die jeweils für 10 min. </li><li> Trocknen der Scheiben unter einem Stickstoffstrom. </li><li> Bereiten Sie eine kleine Menge von Epoxid-Kleber mit Reagenzien gründlich gemischt und Platz ~ 1081; l auf der Stahlplatte. </li><li> Befestigen des Substrats (Muskovit - Glimmer, SiO 2 Kristall, Glas, etc.) auf die Stahlscheibe durch Druck auf das Substrat aufbringt. Lassen Sie das Epoxidharz für mehrere Stunden bei erhöhter Temperatur auszuhärten (Herstellerangaben zu sehen). </li><li> Sicherzustellen, dass kein Epoxid direkt der Luft ausgesetzt wird, um die Kanten des Substrats. Dies geschieht, wenn eine übermäßige Menge an Epoxid verwendet wird, und kann eine Quelle der Kontamination werden. <ol><li> Bei einem Glimmersubstrat, und drücken fest ~ 2,5 cm breites Klebeband auf das Substrat, so dass die gesamte Fläche bedeckt ist, und glatt es abzulösen. Verwenden Sie milde Klebeband und ziehen Sie die Glimmer durch parallel zur Oberfläche zu ziehen. Das entfernte Material wird auf dem Band zu sehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 mal, bis der Glimmer mit dem Auge spiegelglatt ist. </li><li> Für Glas / SiO 2, wenn weitere chemische Oberflächenmodifikation erforderlich ist, wiederholen Sie die Bad-Beschallungs Routine der Schritte 2,1-2,2. Alternativ können Sie UV Belichtungseinheit (18 W UV-C keimtötende Lampen) für 30-60 min, je nach Leistung), um alle organischen Stoffe zu pyrolysieren, die auf der Oberfläche belassen werden. Dieses Verfahren macht auch die Oberfläche hydrophiler ohne Rauheit deutlich zu erhöhen. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Balken und Spitze <ol><li> Tauchen Sie die Cantilever-Chip in einem Bad aus Isopropanol, gefolgt von Reinstwasser, jeweils für 60 min. </li><li> Wenn der Ausleger / Spitze umfangreiche Reinigung erfordert (zB nach längerer Lagerung in Gel - Box), fügen Sie eine 30 min Einweichen in Aceton (&gt; 99,5% Reinheit) vor dem Schritt 1 (siehe auch den Abschnitt Adressierung Kontamination). Die Lagerung von Spitzen in Gel - Boxen ist in unserer Erfahrung, einer der primären Quelle der Verunreinigung , die sehr schnell 59 auftreten können. </li><li> Setzen Sie die Spitze Licht kurz UV (&lt;5 min), um 60 , um die Bildung von stabilen Trinkstellen zu begünstigen. Vermeiden Sie längere Überbelichtung mal, wie es die Spitze beschädigen oder inkRease seinen Krümmungsradius. </li><li> Setzen Sie den Ausleger in die Cantileverhalters der AFM und Pipette ~ 50 ul Imaging-Lösung (die Art der Lösung wird auf der Probe abhängen untersucht, aber in diesem Fall eine 10 mM Lösung von Rubidiumchloridverfahren in Reinstwasser verwenden) auf den Ausleger und Tipp zum vorbefeuchtenden es; Dies wird das Auftreten von Luftblasen zu begrenzen, wenn die Probe nähern. </li></ol> 4. Set-up von AFM Zelle <ol><li> Montieren Sie die Probenscheibe und Substrat auf die Probenbühne und fügen Sie ein Tröpfchen Bildgebung Flüssigkeit (Flüssigkeit typischerweise 2-3 mm Dicke an seinem höchsten Punkt). </li><li> Schließen Sie den Cantileverhalters an die AFM. </li><li> Bringen des Cantilevers und der Probe in die Nähe, um eine kapillare Brücke zwischen den Flüssigkeiten auf dem Ausleger / Spitze und der Probe zu bilden. </li></ol> 5. Initialisieren von Messen und Kalibrieren von Cantilever <ol><li> Richten Sie die Messlaser (meist rot) in der Nähe der Spitze-end des Auslegers. Je nach AFM Modell, tun dies entweder über die Software kontrolliert oder durch manuelle Einstellung der Laserposition. Erwerben Sie die thermische Spektrum der Cantilever in Flüssigkeit (siehe Abbildung 1A). Das Verfahren zeichnet die thermischen Fluktuationen des Auslegers mit Hilfe des Lasers, um die Frequenz des Auslegers Hauptresonanz (grundlegende Eigenmode) zu finden. In den meisten modernen AFM, wird dies durch automatisierte Verfahren in den Software-Kontrollen durchgeführt, aber Details von AFM AFM kann variieren. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Abbildung 1: Tuning und den Ausleger zu kalibrieren. A: Die thermische Rauschspektrum der vertikalen Auslenkung des Auslegers (schwarz) mit einem einfachen harmonischen Oszillator (SHO) Sitz der grundlegenden Eigenmodus (rot). Hier ist die Resonanz ist 18,7 kHz in Wasser. Die ersten drei Resonanzfrequenzen, die mit den ersten drei Biegeeigenformen entsprechen, sind highlighted mit blauen Pfeilen. B: Die Kalibrierung der inversen Optische Lever Empfindlichkeit des Auslegers. Die lineare Auslenkung des Auslegers gedrückt gegen eine starre (nicht verformbar) -Oberfläche verwendet, um den Umwandlungsfaktor (InvOLS) zwischen der Auslenkung in Volt und der entsprechende Wert in Nanometern gemessen zu messen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Nehmen Sie eine Ablenkung in Abhängigkeit vom Abstand Kurve mit dem Ausleger auf einem steifen Substrat (zB Glimmer oder Glas) und kalibrieren die Ablenkung durch die Einführung , dass die Steigung der Kurve im linearen Umlenkbereich (wie in Abbildung 1B) ist die Einheit 61-63. Hinweis: Dieses Verfahren findet den Umwandlungsfaktor zwischen der gemessenen Durchbiegung auf dem Photodetektor (in Volt) und die reale Durchbiegung des Auslegers (in Nanometer) - known als Inverse Optical Lever Empfindlichkeit (InvOLS). Die Kalibrierung kann die Spitze beschädigt werden, so ist es besser, sie zu führen, nachdem alle Messungen abgeschlossen sind. Verwenden Sie den InvOLS Wert für einen anderen Ausleger des gleichen Typs in einem früheren Experiment abgeleitet eine Schätzung zu erhalten (in der Regel&gt; 90% genau) der wahren Amplitude vor der Kalibrierung. </li><li> Den Resonanzspitze im thermischen Spektrum mit einem einfachen harmonischen Oszillator - Modell 64-66 , die Federkonstante des Auslegers zu ergeben. Dieses Verfahren wird in den meisten AFM-Software automatisiert und in der Regel nicht Fachwissen des Modells in Frage erfordern. </li><li> Stellen Sie den Ausleger. Hier finden Sie die Amplitudengang des Auslegers , wenn von außen angetrieben (zB akustisch oder durch photothermische Anregung) über einen Bereich von Frequenzen in der Nähe seiner nominalen Resonanzfrequenz. Stellen Sie die Antriebsfrequenz auf die nahe dem Maximum in diesem Spektrum, leicht nach links. Wenn der Ausleger ist Acoustisch angetrieben, können viele falsche Maxima beim Abstimmen erscheinen. <ol><li> Wählen Sie eine Resonanzspitze so nah wie möglich (und innerhalb der Hülle von) der Resonanz im thermischen Spektrum identifiziert, indem die Steuersoftware des AFM verwendet aber Besonderheiten können auf der Art der Software und der Version abhängen, die die AFM steuert. </li></ol></li></ol> 6. Ansatz und erste Überprüfung der Probe <ol><li> Stellen Sie die Antriebsamplitude, so daß die freie Schwingungsamplitude etwa 5 nm ist. Diese typischerweise auf 0,2-0,8 V bei den meisten AFMs entspricht (im Fall, dass die InvOLS nicht kalibriert). Stellen Sie die Amplitude Sollwert auf ~ 80% der freien Amplitude. </li><li> Stellen Sie die Rückkopplungsverstärkungen relativ hoch (der absolute Wert auf der AFM hängt), aber dafür sorgen, dass keine Instabilität oder Klingeln auftritt. </li><li> Stellen Sie den ersten Scan - Rate und Scangröße auf kleine Werte (zB auf ~ 1 Hz und 10 nm beziehungsweise). Dies hilft, die Spitze bei einigen Feedbackparameter erhalten schlecht angepasst werdendurch Scannen über große Entfernungen vermieden wird. Die Scan - Größe kann anschließend auf einen größeren Wert erhöht werden (zB 100 nm) , wenn die Scanbedingungen geeignet erscheinen. </li><li> Bestimmen Sie die ungefähre Höhe der Oberfläche (in einigen Fällen ist dies optisch getan werden muss) vor dem Ansatz. </li><li> Starten Sie den Ansatz der Spitze an der Oberfläche mit der AFM-Steuerungssoftware. Die feinen Details dieses Prozesses auf dem Modell der AFM und Software verwendet wird, abhängen. <ol><li> Wenn es Probleme mit dem Ansatz sind, wenn sie mit einem weichen Cantilever mit, führen Sie den Ansatz im Kontaktmodus. In diesem Fall sicher, dass die Gewinne sind niedriger als im AM-Modus, und stellen Sie den Sollwert auf einen relativ niedrigen Wert (0,1-0,2 V nach den Laser auf den Photodetektor Zentrierung), um die Spitze zu erhalten. </li><li> Beurteilen Sie, ob die Spitze die Oberfläche durch geringfügige Änderung des Sollwertes (Anstieg im Kontaktmodus oder Abnahme der AM-Modus) ohne beginnend Bild erreicht hat. Wenn die Spitze an der Oberfläche, die Wirkung auf die ter Verlängerung der Z-Piezo sollte vernachlässigbar sein. Die Live-Bewegungen der Z-Piezo werden gewöhnlich graphisch in der Steuerungssoftware der meisten AFM angezeigt. Wenn die Sollwertänderung eine sichtbare Bewegung des Piezo auslöst, deutet dies auf eine falsche engagieren. Im letzteren Fall wieder starten Sie den Ansatz von der aktuellen Spitzenposition, eine etwas höhere (Kontakt) oder niedriger (AM) Sollwert verwendet wird. </li></ol></li><li> Sobald die Spitze die Oberfläche erreicht hat, fahren Sie das Z-Piezo (in der Regel durch einfaches Drücken der Taste &quot;Stop&quot;) und Neuabstimmung der Ausleger (Wiederholen Sie Schritt 5.4.); die Resonanzfrequenz wahrscheinlich auf einen niedrigeren Wert aufgrund Spitze-Probe-Interaktionen haben sich verschoben. </li><li> Ändern Sie den Sollwert auf ~ 80% der neu freie Amplitude abgestimmt (an dieser Spitze-Probe-Abstand). </li><li> Aktivieren Sie den Ausleger und führen eine 10 × 10 nm 2 Abtastung der Oberfläche im AM - Modus , um zu überprüfen , dass die Abbildungsparameter geeignet sind. <ol><li> Überprüfen Sie, ob die Spur (Scannen von links nach rechts) und zurückzuverfolgen (Scannen von rechts nach links)Profile überlagern. Wenn nicht weiter den Sollwert zu reduzieren und versuchen, den Gewinn zu erhöhen. </li><li> Senken Sie die Gewinne, wenn das Bild laut wird. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit einem großen - 1 × 1 &amp; mgr; m 2 bis 5 × 5 &amp; mgr; m 2 - Scan der Probe , sofern dies möglich ist. Auf weichem oder biologischen Proben, könnte dies eine Kontaminierung der Spitze führen. </li></ol> 7. hochauflösende Bildgebung <ol><li> Reduzieren Sie die Scangröße auf einen Wert geeignet zur Visualisierung der Funktionen (zB 100 × 100 nm 2 für Proteinkristalle oder 20 × 20 nm 2 für Glimmer oder Calcit). </li><li> Reduzieren die Antriebsamplitude des Auslegers genug für die Rückkopplungsschleife automatisch die Z-Piezo zurückzuziehen und somit die Spitze von der Oberfläche. Während der Ausleger von der Oberfläche entfernt ist, passen die Antriebsamplitude, so daß der Kragarm Amplitude ~ 1-2 nm (peak-to-peak). </li><li> Mit Hilfe der AFM-Steuerungssoftware, progreslich reduzieren zu einem Zeitpunkt, der Sollwert ein paar Dutzend mV bis die Z-Piezo in Richtung der Oberfläche erstreckt wieder und das ursprüngliche Bild zurückgewonnen wird. Halten Sie die Sollamplitude zwischen 75% und 95% der neuen freien Amplitude. </li><li> Nachjustieren die Gewinne der AFM-Steuerungssoftware; höhere Gewinne können, ohne dass signifikante Rauschen bei niedrigeren Amplituden verwendet werden. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 7,2-7,4, um die beste Kombination aus freier Amplitude, Soll- und gewinnen für die hochauflösende zu bestimmen. Die optimalen Bedingungen sind abhängig von der Probe (Solvatation Landschaft und Benetzungseigenschaften der Flüssigkeit), sondern auch der Ausleger (Federkonstante, Steifigkeit). </li><li> Erforschen verschiedene Kombinationen von Amplituden Abbildungsbedingungen zu optimieren. Es kann notwendig sein , wieder 42 die freie Amplitude zu erhöhen. In einem solchen Fall stellen die ersten Sollwert auf einen höheren Wert und dann die Antriebs erhöhen (dh umgekehrte Prozedur als die Amplitude zu verringern , verwendet wird ). </li><li> Halten Sie die setpoint Amplitude im Bereich von 0,5 nm - 1,5 nm (peak to peak) mit Sollwertverhältnisse über 0,7 gehalten (typischerweise 0,75 bis 0,95). Für solvophilic Schnittstellen verwenden Cantilever mit einer Federkonstante von 0,5 bis 2 N / m. Dies ist ausreichend für die Spitze der größte Teil der Grenzflächen-Flüssigkeit zu entfernen, ohne die Oberfläche zu treffen. Eine Daumenregel wird in Gl vorgeschlagen. 4 von Referenz 29. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Seit seiner Erfindung vor drei Jahrzehnten, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 1 hat sich als Methode der Wahl etabliert für Proben im Nanobereich zu untersuchen, insbesondere dort , wo makroskopische Oberflächenbereiche von durchschnittlich über nicht möglich ist und lokale Informationen erforderlich ist . In einer typischen AFM-Messung wird die Durchbiegung eines flexiblen Auslegers verwendet, um die Wechselwirkungskraft zwischen einer kleinen Anzahl von Molekülen und einer Ultra Spitze am Ende des Auslegers montiert ist, zu quantifizieren. Je nach Art der Interaktion und die betrachteten Zeiträume kann ein breites Spektrum an Informationen abgeleitet werden, einschließlich der viskoelastischen Eigenschaften von weichen biologischen Membranen 2,3, die Stärke eines einzelnen chemischen oder molekulare Bindung 4,5, die atomistische Details eines Oberfläche von 6 bis 8, der magnetische 9, kapazitiv 10, 11, 12,13 thermischen und chemischen Eigenschaften von Proben 14 leitend <sup&gt; 15. Ein Teil des Erfolgs von AFM ist seine Fähigkeit , auf eine breite Palette von Materialien 16 und in verschiedenen Umgebungen wie Vakuum 17, Gas 11,18 oder Flüssigkeit 19,20, zu arbeiten , weil es auf einer bestimmten Kraft beruht nicht zwischen Sonde und Probe . In der Praxis jedoch kann eine Herausforderung und viele veröffentlichte Ergebnisse werden unter anderen Bedingungen als Umgebungs die AFM in Betrieb sind immer noch in der Luft erhalten. Eine zusätzliche Schwierigkeit kommt von der Tatsache, dass es in der Regel notwendig ist, die AFM im dynamischen Modus (vibrierende Spitze) zu betreiben, um durch Vermeidung großer Reibungskräfte sowohl Spitze und der Probe zu erhalten. Obwohl eine größere Herausforderung, kann den dynamischen Betrieb im Prinzip liefern weitere Informationen über die analysierten Probe und ohne Verlust an räumlicher Auflösung. Im letzten Jahrzehnt hat sich das Gebiet der dynamischen AFM in Flüssigkeit wichtige Entwicklungen gesehen, aus dem Aufkommen der AFM Video-Rate von 21 bis 23, auf Multifrequenz Messungen <sup&gt; 24,25 und Sub-Nanometer - Bildgebung von Trinkstrukturen an Grenzflächen 26 - 31. AFM - Betrieb , während in Flüssigkeit eingetaucht wird nun routinemäßig in der Biologie und Biophysik verwendet 32-36, Polymerforschung 37, Elektrochemie 38-40 und Fest-Flüssig - Charakterisierung Schnittstellen 41-44. Das Vorhandensein von Flüssigkeit um die schwingende Ausleger verändert erheblich seine Dynamik 45 sowie die Wechselwirkung zwischen der Spitze und der Probe 29,42. Bei richtiger Anwendung kann die Flüssigkeit ausgenutzt werden , um die Bildauflösung 26,29, mit einer typischen Verbesserung um fast eine Größenordnung zu verbessern im Vergleich zu der besten Auflösung 46 unter Umgebungsbedingungen erreicht. In AFM, die höchste räumliche Auflösung erreichbar für eine bestimmte Messung hängt sowohl von der Qualität des AFM selbst und der Art der ter Interaktion sondiert 20,47,48. In der heutigen Zeit, die meisten High-End, im Handel erhältliche AFMs vorhanden Lärmpegeln, die der von 12 thermische Grenze nahe sind , so der bestimmende Faktor für die Auflösung ist in der Regel die Spitze-Probe Wechselwirkung. Es ist effektiv der räumliche Gradient dieser Wechselwirkung, die die Auflösung bestimmt: Messungen basierend auf Kurzstrecken, schnell abklingenden Interaktion erzeugen höhere Auflösung Ergebnisse als bei der längerfristige Interaktionen im Spiel sind. In Flüssigkeit kann Solvatation Kräfte Bildauflösung verbessern , weil sie dazu neigen , nur wenige Moleküldurchmesser der Flüssigkeit (typischerweise &lt;1 nm) beim Anfahren 49 der Probe von der Oberfläche verschwinden über. Diese Kräfte entstehen aus der Wechselwirkung zwischen den Flüssigkeitsmolekülen und der Oberfläche der Probe. Eine Flüssigkeit mit einer starken Affinität für die Oberfläche wird dazu neigen , geordneteren und weniger mobil als bulk Flüssigkeit an der Grenzfläche mit der Probe 29,42,50 sein. Als Ergebnis,es wird mehr Energie für einen vibrierenden AFM - Spitze nehmen Grenzflüssigkeitsmoleküle als Bulk - Flüssigkeit 42 zu verdrängen, -die Solvatation Landschaft die Messung sehr empfindlich auf lokale Schwankungen der Grenzflüssigkeitseigenschaften im Nanobereich zu machen. Um berücksichtigt zu nutzen, müssen Solvatation Kräfte, einige praktische Aspekte getroffen werden. Zuerst werden die Schwingungsamplitude der Spitze zu dem Bereich der Solvatation Kräfte vergleichbar benötigt, typischerweise &lt;1 nm. Zweitens verwendet die Flüssigkeit eine wohldefinierte Solvatation Landschaft an der Oberfläche der Probe bilden müssen. Makroskopisch ist das Äquivalent eines &quot;Benetzung&quot; Flüssigkeit für die Probe als zu erfordern. Zum Beispiel in Wasser ist es einfacher , auf molekularer Ebene Auflösung auf hydrophilen Glimmer zu erreichen als auf hydrophoben Graphit 42,51. Schließlich muß die Federkonstante des Auslegers mit der Spitze Stütz entsprechend 52,53 gewählt werden. Wenn in diesen con ArbeitsBedingungen, wird das AFM nicht nur auf molekularer Ebene Bilder der Schnittstelle zur Verfügung stellen, aber es ergibt sich auch Informationen über die lokale Probe-Flüssig - Affinität , die 54 chemische Informationen über die Probenoberfläche zu gewinnen , verwendet werden kann. Die gebräuchlichsten dynamischen Betriebsarten für AFM in flüssigen Amplitudenmodulation (AM, auch &quot;Tapping-Modus &#39;) AFM und Frequenzmodulation (FM) AFM. Im ersten Fall 55 tastet raster die Spitze der Probe während ihrer Schwingungsamplitude durch eine Rückkopplungsschleife konstant gehalten wird , die kontinuierlich mit der Spitze-Probe - Abstand wieder einstellt. Ein topographisches Bild der Probe wird aus der durch die Rückkopplungsschleife angelegt Korrektur erhalten. Im FM-AFM 28,41,56, ist es die Schwingungsfrequenz des Auslegers / Spitze , die konstant gehalten wird , während die Spitze die Probe abtastet. Beide Techniken bieten vergleichbare topographische Auflösung in flüssiger 36,57. Die Quantifizierung der Spitze-Probe Wechselwirkung neigt dazu, mehr strai zu seinghtforward und präzise in FM-AFM, aber AM-AFM ist einfacher zu implementieren, robuster und ermöglicht mit weicher Auslegern, etwas Nützliches für die Untersuchung leicht verformbar oder empfindliche Proben arbeiten. Bezeichnenderweise ist AM-AFM mehr unter AFM Benutzer verbreitet, teilweise aus historischen Gründen, sondern auch aufgrund der Tatsache, dass es technisch einfacher zu steuern ist. Obwohl die Amplitude, die durch die Rückkopplungsschleife während der AM-AFM-Bildgebung konstant gehalten wird, wird die Phasenverzögerung zwischen der Spitze und dem Schwingungsantriebsschwingung frei zu ändern erlaubt. Die Phasenverzögerung kann nützliche Informationen über die Spitze und Probe - Wechselwirkungen liefern, auf die während der Schwingung der Spitze an der Schnittstelle mit der Probe 58 absorbierten Energie bezogen ist. Daher phasen Bildgebung kann gleichzeitig topographische Bildgebung erfasst werden, und ist oft komplementäre die Heterogenität einer Probenoberfläche in Hervorhebung. Phase Bildgebung wurde für verschiedene Mapping von Interaktionen verwendet, einschließlich der direct Kartierung der Haftungsenergie 42, viskoelastischen Eigenschaften 58 und die Hydratisierung Landschaft einer Schnittstelle 44. Praktisch, Bilder mit hoher Auflösung in Flüssigkeit erhalten bleibt nicht-trivial aufgrund der großen Anzahl von Parametern zu steuern, und das Fehlen einer einfachen und systematischen Protokoll, das in jeder Situation funktioniert. Die Bildqualität hängt typischerweise von dem Cantilever Geometrie und Elastizität der Spitze der Chemie, die Schwingungsamplitude und die Probe Steifigkeit unter anderem 55. AFM-Messungen sind ebenfalls per definitionem perturbativen an das System. Als Ergebnis Abbildungs ​​ändernden Variablen und Umgebungsbedingungen ohne angemessene Überlegungen können zu Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit und / oder misrepresentative Beobachtungen und falschen Ergebnissen führen. Hier präsentieren wir unser Protokoll für hochauflösende Bilder von harten und weichen Proben in Lösung zu erzielen, kommerziellen Instrumenten in ampl betrieben wirdITUDE-Modulation. Unser Ziel ist es, die wichtigsten Parameter für die Optimierung der wahrscheinlich ein praktisches Verfahren anzubieten, um die Auflösung über verschiedene Proben zu beeinflussen, in jedem Fall erläutert die Gründe für unsere Entscheidungen von den physikalischen Prinzipien der Abbildungsprozess zugrunde liegen. Wir Detail ein Schritt-für-Schritt-Ansatz, von der Substratreinigung und Vorbereitung der Wahl der Ausleger, Anpassung der Bildparameter und gemeinsame Probleme Fehlerbehebung. Die Erklärung der wissenschaftlichen Gründe für unsere Entscheidungen und Verfahren für die hochauflösende sollte machen rationale Entscheidungen helfen, wenn die Methodik zur Anpassung und dienen als Ausgangspunkt für die Bildgebung neuartiger Systeme. In diesem Text verwenden wir AM zur Amplitudenmodulation Betriebsart eines AFM zu verweisen. Wir verweisen auf die Feedbackparameter entweder während der Cantileverauslenkung (Kontaktmodus) oder Schwingungsamplitude (AM - Modus) als Sollwert konstant gehalten wird . Im AM-Modus wird der Ausleger nach außen getriebenentweder durch eine akustische Schwingung oder durch einen gepulsten Laser an der Basis des Auslegers gerichtet. Die Antriebsamplitude ist die Intensität des externen Schwingungssignal. Der absolute Wert der Antriebsamplitude benötigt, um eine gegebene Schwingungsamplitude des Auslegers zu erzielen, hängt von vielen Parametern ab, wie beispielsweise das Verfahren zum Betreiben (acoustic, Lichtwärmeumsetzmaterial oder magnetisch), Cantilever Fixierung und Parameter (Steifigkeit, Geometrie) und Laserausrichtung. Der genaue Wert der Antriebsamplitude ist daher nicht relevant, aber es ist in jedem Versuch eingestellt, um eine geeignete (und quantifizierbare) Schwingungsamplitude des Auslegers vorzusehen. Wenn die angetriebene Ausleger weit weg von der Probe und keine Dämpfung ihrer Schwingung erfolgt durch Spitze-Probe - Wechselwirkungen, wird dessen Schwingungsamplitude die freie Schwingungsamplitude bezeichnet. Da die schwingende Spitze die Oberfläche der Probe nähert, beginnt seine Amplitude zu verringern. Wenn die Rückkopplung aktiviert ist, wird die z-piezo constantly neu zu justieren ihre Verlängerung, so dass die gewählte Sollamplitude, konstant zu Kiel. Der Sollwert ist in der Regel immer kleiner als die freie Amplitude. Es ist üblich , auf den Sollwert - Verhältnis zu beziehen, das Verhältnis der Sollamplitude (Abbildungsamplitude) über der freien Amplitude. Je kleiner der Sollverhältnis ist, desto härter die Abbildungsbedingungen sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode IIIA AFM</td>
			<td style="width:121px;">Brucker</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td style="width:303px;">One of the machine used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cypher ES AFM</td>
			<td style="width:121px;">Asylum Resarch</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td>One of the machine used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM cantilever/tip</td>
			<td style="width:121px;">Nanoworld</td>
			<td style="width:171px;">Arrow UHF-AUD</td>
			<td>best for high frequency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM cantilever/tip</td>
			<td style="width:121px;">Olympus</td>
			<td style="width:171px;">RC800-PSA</td>
			<td>versatile and cheap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ultrapure water</td>
			<td style="width:121px;">Milipore</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td>lab filtering systems can induce contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aaldrich</td>
			<td style="width:171px;">200-664-3&#160;</td>
			<td>standard chemical, no further purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monovalent salts</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aaldrich</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>standard chemical, no further purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lipids</td>
			<td style="width:121px;">Avanti polar lipids</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>lipid bilayers formed using stadard protocols</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystals</td>
			<td style="width:121px;">MTI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>polished crystals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:121px;">3M</td>
			<td style="width:171px;">Scotch Magic Tape</td>
			<td>Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-nanometer resolution imaging with amplitude-modulation atomic force microscopy in liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

Das Protokoll im vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde, mit mehreren kommerziellen AFMs zu erreichen molekular- oder atomarer Ebene Bilder erfolgreich angewendet. Alle Bilder wurden mit Arbeits Amplituden zwischen 0,5 nm und 1,5 nm eingestellt individuell nach dem Verfahren erhalten die Schritte 7,1-7,4. Die Ergebnisse könnten eine breite Palette von weichen (Abbildung 2) und steif (Abbildung 3) Proben erhalten über werden. In jedem Fall werden die Merkmale von Interesse hervorgehoben. Einer der großen Vorteile der Technik ist , dass kleine Schwingungsamplituden und hohe Sollwerte , die von der Spitze auf die Probe, so dass fragile Selbstbaugruppen von Lipiden (2A), Proteine (2B und D) ausgeübte Kraft zu minimieren, und amphiphile Moleküle (2C) ohne Beschädigung in Lösung abgebildet werden. Härtere kristallinen Materialien wie Mineralien (3A, B, D) undeinzelne Metallionen auf einer Oberfläche adsorbiert ist (3C), da in jedem Fall mit dem Ansatz abgebildet werden, ist es die Grenzflächenflüssigkeit , die wirksam mit dem Protokoll abgebildet wird beschrieben. Die Solvatation Kräfte sind vergleichbar mit den Proben gezeigt , die Figuren 2 und 3: alle Proben hydrophil sind (allgemeiner &quot;solvophilic&quot; im Fall von 2C, 3B, 3D) in Bezug auf die Abbildungs Lösung. Konsequent, Auslegern mit vergleichbarer Steifigkeit (0,2 bis 0,8 N / m) wurden in allen Fällen verwendet. Sowohl die Probe und der Spitze sollte solvophilic sein, um sicherzustellen, dass Flüssigkeitsmoleküle eine wohldefinierte Solvatation Struktur bilden, die abgebildet werden kann. Dies ist nicht immer eine hinreichende Bedingung, aber in den meisten Fällen und für relativ kleine Flüssigkeitsmoleküle, die Flüssigkeitswieder Strukturen selbst in einer Weise, dass die Probe Symmetrie nachahmt. Der Haupttreiber des hochauflösenden ist die lokale Veränderung in der Affinität der adsorbierten Lösungsmittelmolekülenfür die Oberflächen (Ångström-Skala, im Fall von 2A, 3A, 3C). Die Technik ist daher am besten für Materialien geeignet, bei denen die Lösungsmittel-Struktur über die Oberfläche in großem Maße variiert. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Abbildung 2: Soft - Schnittstellen abgebildet durch AM-AFM in wässrigen Lösungen. A: Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) Lipid - Doppelschicht in Gelphase abgebildet in in 150 mM KCl. Die hexagonal gepackten Lipidkopfgruppen unterscheiden sich sowohl in Topographie und Phase, zusammen mit lokalen Kontrast anzeigt, ortsspezifische Variationen in Feuchtigkeit. B: Lila Membranen von Halobacterium salinarum abgebildet in 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH - Wert 7,4. Mehrere Bakteriorhodopsin Proteintrimere werden hervorgehoben. Die Phase zeigt einen Kontrast unterscheidet sich von Topographie aufgrund der örtlichen Trinkstellen auf den Proteinen. Einzelne Proteintrimere<html> werden kann (gestrichelte Linien) hergestellt werden. C: Amphiphile Farbstoff (Z907) Moleküle an der Oberfläche eines Nanopartikels TiO 2 in einer farbstoffsensibilisierten Solarzelle adsorbiert. Das Bild wurde in Ethyl-isopropyl Sulfon erworben. Die schwammartige Aussehen wird durch die adsorbierten Farbstoffmoleküle erzeugt. D: Aquaporin Kristall in nativen Rinderlinse Membranen in dem gleichen Puffer wie B. Ein Aquaporin Tetramer abgebildet wird hervorgehoben. Unterkonstruktion entsprechend interspiralförmigen Schleifen sind sichtbar in der Topographie, während Phase einen auffallend unterschiedlichen Kontrast aufgrund der ungewöhnlichen Wasserverhalten in der Nähe des Proteins zeigt. Die Bilder werden von Lit. 36 (B) angepasst, ref 38 (C) und ref 67 (D). Der Maßstab beträgt 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm (C) und 15 nm (D) Die Farbskala zeigt jeweils eine Höhe und Phasenvariation von 200 pm und 15 ° (A), 600 pm und 4 ° (B), 2,5 nm und 2,5 ° (C) und 1,6 nm und 9,5 ° (D).Last / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative AM-AFM - Aufnahmen von harten Proben in Fluidlösungen. A: Kalzitkristal [ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Oberfläche in einer äquilibrierten Reinstwasser Lösung abgebildet. B: Strontiumtitanat abgebildet in Dimethylsulfoxid erhalten (DMSO). Hochauflösende war in Wasser nicht möglich. C: Muskovitglimmer abgebildet in 3 mM RbCl - Einzel adsorbiert Rb + -Ionen sind sichtbar auf den Gitterplätzen der Glimmer in beiden Phase und Höhe Scans. D: Siliziumkarbid in in DMSO abgebildet. Die erwarteten kristallographischen Anordnungen sind in den Bildern B und D. Die Bilder werden aus Lit. 68 (A), ref 42 (B und D) angepasst gezeigt,und ref 44 (C). Der Maßstabsbalken ist 3 nm (A, B, D) und 5 nm (C). Die Farbskala zeigt jeweils eine Höhe und Phasenvariation von 250 pm und 14 ° (A), 600 pm und 5,5 ° (B), 800 Uhr und 15 ° (C) und 500 pm und 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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