Name: from a natural product to its biosynthetic gene cluster: a demonstration using polyketomycin from streptomyces diastatochromogenes t&#252;6028
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÂ¼6028 at JoVE.com

S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of T&#252;bingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).

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The authors have nothing to disclose.

このラボでは、ストレプトミセスdiastatochromogenesのゲノムコスミドライブラリーが生成され、非常に時間のかかるプロセスを経てpolyketomycin遺伝子クラスターの同定、その結果、何年も前にスクリーニングしました。単一の遺伝子の特徴付けは、標的遺伝子の欠失と、得られた変異体12の分析を使用して可能でした。最近、 エス・diastatochromogenesのドラフトゲノム配列はpolyketomycin生合成遺伝子クラスターの高速同定を可能に得られました。ドラフトゲノム配列は、まだ多くのコンティグが含まれていますが、我々は簡単に、生合成遺伝子を検出することができました。記載された方法はヶ月以内に達成することができます。しかし、この手順は多くのステップを含みます。シングルステップは、その後の工程への進行を防止、数回失敗することがあります。 ストレプトマイセス属の生物活性化合物を生成するその能力のために知られています。彼らはしばしば20以上の経歴を運ぶながら、ynthetic遺伝子クラスターは、通常、1つまたは2つの化合物は、実験室条件下で製造されます。サイレント遺伝子クラスターをウェイクアップするOSMACアプローチ（さまざまな条件の下で1株の栽培）の適用は、時には十分ではありません。このような多面的な調節遺伝子ADPA 44とbldA 45,46などの調節遺伝子の遺伝子操作は、他の二次代謝産物の産生を活性化するための有効な方法です。 NMR分析により、例えば 、化合物の構造の解明については、精製された化合物の通常以上の2mgが必要です。そのため、10以上のL培養液の発酵はしばしば必要とされます。酸素、pHおよび温度条件を維持することができる発酵槽がなければ、文化やその後の抽出のこの量を処理するために、小さな研究室で挑戦されることがあります。精製中に、化合物は、酸化による、放射線や温度に変化させてもよいです。また、多くの精製工程が高く、分解の可能性を使用しています。 天然物の構造、およびゲノム内のクラスタを分析するとき、時には適切なクラスタを識別することは容易ではありません。唯一のドラフトゲノム配列がある場合はまず、クラスタの一部が失われることがあります。第二に、生合成に必要とされていない全ての遺伝子は、クラスタ内にあります。第三に、時々クラスタは、多くのキロベースにより互いに分離2つの部分に分割されます。第四に、適切な遺伝子クラスターであるかを決定することは困難です。モジュールの数に基づいて、延長部の数を計算し、あるいは、選択領域の解析によって、単一のエクステンダー単位を特定することができる大型PKS I型またはNRPS系の場合には簡単になります。しかし、反復作業酵素の場合に合成した化合物の予測は、特にストラ場合、しばしば不可能です中には40以上の遺伝子クラスターを持っています。第五に、自然は非常に複雑で、まだ未知の化合物がいっぱいです。多くの場合、生合成は、異なる経路の混合物です。新規化合物はまだ同定、またはしない他の化合物に関連していない場合には、クラスタを識別するために生合成のモデルを提案し、それを証明することは困難です。 クラスタが識別されると、単一のクロスオーバー技術は、仮説を検証するために良いと迅速な方法です。 PCRは、自殺ベクター、抱合、陽性クローンの選択、産生アッセイへのクローニングに必要な唯一のステップです。この技術の一つの欠点は、染色体へのベクターの組込みを伴うさらなる組換え事象に安定していないということです。したがって、さらなる単一の遺伝子を分析するために、正確な遺伝子欠失が必要です。また、遺伝子レベルでストレプトミセス株を操作するためにトリッキーなことがあります。 記載された手順は、Tを割り当てることができストレプトミセス株または他の微生物によって産生される任意の他の化合物O。生合成遺伝子クラスターとその合成された化合物についての知識は、私たちに多剤耐性病原体との戦いのためにそれらを改善する目的で、既存の分子を修飾するためのさらなる機会を提供します。

植物や微生物由来の天然物は、常に臨床薬剤開発や研究のための重要な源となっています。最初の抗生物質ペニシリンは、アレクサンダー・フレミング1によって菌から1928年に発見されました。今日、より多くの天然物は、臨床治療に使用されます。 異なる生物活性との二次代謝産物の様々な種類を生産する能力のために知られている一つの属は、Streptomycesです。 ストレプトマイセスは、グラム陽性菌であり、放線菌のクラスと放線菌目に属します。臨床的に使用される抗生物質のほぼ三分の二は、3またはテトラサイクリン4ダプトマイシン、アムホテリシン2のように、主にストレプトミセスから、放線菌由来しています。二つのノーベル賞は、 ストレプトミセス抗生物質研究の分野で授与されています。第1は、ストレプトマイシンの発見、最初のANのためセルマン・ワクスマンに行ってきました結核に対して有効tibiotic。 5 2015年、医学生理学でのノーベル賞の一環として、S。アベルミチリスからのアベルメクチンの発見は、同様に授与されました。アベルメクチンは、寄生虫疾患6,7の治療のために使用されます。 そのようなストレプトマイセスなどの微生物で天然物の発見のための伝統的なアプローチは、一般に、異なる増殖条件下で菌株の栽培だけでなく、二次代謝産物の抽出と分析を含みます。生物活性アッセイ（抗菌および抗癌活性についてのアッセイなど ）は、化合物の活性を検出するために行われます。最後に、目的の化合物を単離し、化学構造が解明されています。 天然産物の構造は、多くの場合、複雑な分子を形成している単一の部分から構成されています。圏の構築につながるいくつかが、限られた、主要な生合成経路があります。天然物の生合成のために使用されるKS、。主要な生合成経路は、糖部分に至るポリケチド経路、アミノ酸を用いテルペノイドおよびアルカロイド、経路に至る経路、および経路です。各経路は、特定の酵素8のセットによって特徴付けられます。化合物の構造に基づいて、これらの生合成酵素を予測することができます。 最近では、次世代シーケンシングとバイオインフォマティクス解析と組み合わせた化合物の詳細な構造解析が責任を生合成遺伝子クラスターを識別するのに役立ちます。クラスタ情報は、さらに、天然物の研究のための新しい方法を開きます。これは、天然の生成物の収率を増加させるための異種発現を含む、遺伝子欠失もしくは改変、および他の経路からの遺伝子と組み合わせ生合成により化合物の修飾を標的。 Polyketomycinは、培養ブロスから独立して単離しました。2株、 ストレプトミセス・エスピー。 MK277-AF1 9およびストレプトミセスdiastatochromogenesTü602810。構造は、NMRおよびX線分析によって明らかにされました。 Polyketomycinは、β-D-amicetoseおよびα-L-axenose 2デオキシ糖部分によってリンクされ、四環decaketidとジメチルサリチル酸で構成されています。それも、そのようなMRSA 11などのグラム陽性多剤耐性株に対して、細胞傷害性および抗菌活性を表示します。 S. diastatochromogenesTü6028のゲノムコスミドライブラリーが生成され、何年も前にスクリーニングしました。 41遺伝子を含む、52.2キロバイトのサイズでpolyketomycin遺伝子クラスターを特定の遺伝子をプローブ使用して、強烈なワーク12の数ヶ月後に同定されました。最近、 エス・diastatochromogenesのドラフトゲノム配列はpolyketomycin生合成遺伝子クラスターの高速同定につながる得ました。この概要では、この方法は、iDENはに貢献します天然物をtify、その生合成遺伝子クラスターは、一例としてpolyketomycin用いて、説明する明らかにする。 ここでは、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028によって生成polyketomycinのために示され、その生合成遺伝子クラスターに天然物から導く単一の手順を説明します。プロトコルは、抗生物質特性を有する天然産物の同定および精製を含みます。また、構造解析および生合成遺伝子クラスターの同定ゲノムマイニングリードからの結果との比較。この手順は、Streptomyces株または他の微生物に由来する任意の他の化合物にも適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1334">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">agar</td>
			<td style="width:397px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">5210.4</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">agarose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6352.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-mannitol&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">LB&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X964.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malt extract&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X976.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peptone&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">soy flour&#160;</td>
			<td style="width:397px;">W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td>Hensec-Vollsoja</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tryptic soy broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X938.3</td>
			<td>Caso-Bouillon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">yeast extract&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">3738.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetone&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">9372.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:397px;">Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands</td>
			<td>JT-9012-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dichlorofrom&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>1530754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D</td>
			<td style="width:397px;">ARMAR Chemicals, D&#246;ttingen, Switzerland</td>
			<td style="width:231px;">15200.204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Ethyl acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6784.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6331.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">7342.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">restriction enzymes</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">polymerase&#160;</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment</td>
			<td>Promega GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">apramycin</td>
			<td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany&#160;</td>
			<td style="width:231px;">A7682.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">fosfomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:231px;">P5396-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Plasmid/Vectors</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pKC1132</td>
			<td style="width:397px;">Bierman et al. 1992</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Primer&#160;</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pokPI_for</td>
			<td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Primer to amplify fragment containing pokPI gene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pokPI_rev</td>
			<td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Bacterial strains</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td>
			<td></td>
			<td>Gram-positive test strain&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Escherichia coli ET12567 pUZ8002&#160;</td>
			<td>MacNeil et al., 1992</td>
			<td>strain for conjugation&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Escherichia coli XL1 Blue</td>
			<td style="width:397px;">Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td colspan="2">Gram-negative test strain + cloning host&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028</td>
			<td style="width:397px;">Paululat et al., 1999</td>
			<td>Polyketomycin producer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Online services</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td>
			<td style="width:397px;">http://antismash.secondarymetabolites.org/</td>
			<td colspan="2">Detection of secondary metabolite gene cluster</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td>
			<td style="width:397px;">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
			<td colspan="2">finds regions of similarity between biological sequences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">GenDB</td>
			<td style="width:397px;">https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)</td>
			<td style="width:397px;">http://mibig.secondarymetabolites.org/</td>
			<td colspan="2">Database of biosyntetic gene clusters</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaPDoS</td>
			<td style="width:397px;">http://napdos.ucsd.edu/</td>
			<td colspan="2">Detection of seconary metabolite gene cluster</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline</td>
			<td style="width:397px;">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NRPSpredictor</td>
			<td style="width:397px;">http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td>
			<td>Detection of NRPS domains</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Prokka (rapid prokaryotic genome annotation)</td>
			<td style="width:397px;">http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">RAST (rapid annotation using subsystems technology)</td>
			<td style="width:397px;">http://rast.nmpdr.org/</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">other programs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Chem Station Rev. A.09.03</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td style="width:231px;">Handling program for HPLC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Clone Manager Suite 7</td>
			<td style="width:397px;">Scientific and Educational Software, Cary, USA</td>
			<td style="width:231px;">Designing Cloning Experiment&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Newbler v2.8</td>
			<td style="width:397px;">Roche Diagnostics</td>
			<td>Alignment of sequencing reads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Machines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC/MS</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Autosampler: G1313A</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Column:Xbridge C18 (100 mm &#215; 4.6 mm; Particle size: 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Degasser: G1322A&#160;</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Quarternary pump: G1311A</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Diode array detector (DAD )G1315B (&#955; = 254 nm and 400 nm)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_heating bath Hei-VAP Value/G3</td>
			<td colspan="2">Heidolph Instruments GmbH &#38; Co.KG, Schwabach, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_vacuum pump system SC 920 G</td>
			<td>KNF&#160;Global Strategies&#160;AG, Sursee, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">other material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Sephadex LH20</td>
			<td style="width:397px;">GE Healthcare,&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 &#181;m; filter &#216;15 mm)</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL GmbH &#38; Co. KG, D&#252;ren, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td>
			<td style="width:397px;">Waters GmbH, Eschborn, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacillus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomyces sp.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for agar plates add 2 % agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a natural product to its biosynthetic gene cluster: a demonstration using polyketomycin from streptomyces diastatochromogenes t&#252;6028

ストレプトミセス株は、様々な生理活性を有する異なる化合物の多くを生成する能力のために知られています。異なる条件下での栽培は、多くの場合、新規化合物の生成をもたらします。したがって、株の産生培養物を酢酸エチルで抽出し、粗抽出物をHPLCにより分析します。さらに、抽出物を異なるアッセイによって、それらの生物活性について試験します。構造解明のための関心対象の化合物は、様々なクロマトグラフィー法の組合せにより精製されます。 ゲノムマイニングに結合されたゲノム配列は、別のコンピュータープログラムを使用して天然物の生合成遺伝子クラスターの同定を可能にします。正しい遺伝子クラスターが同定されたことを確認するために、遺伝子不活性化実験を実行しなければなりません。得られた変異体は、特定の天然産物の生産のために分析されます。正しい遺伝子クラスターは、不活性化されると、株は、化合物を生成するために失敗する必要があります。 ワークフローは、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028によって生成される抗菌性化合物のpolyketomycinのために示されています。約10年前、ゲノム配列決定はまだ非常に高価だったときに、遺伝子クラスターのクローニングおよび同定は非常に時間のかかるプロセスでした。ゲノムマイニングと組み合わせた高速ゲノムシーケンシングは、クラスタ識別の裁判を加速し、生合成を探索する遺伝的方法によって、新規な天然物を生成するための新しい方法を開きます。この論文に記載されているプロトコルは、Streptomyces株または他の微生物に由来する任意の他の化合物に割り当てることができます。

この概要では、その生合成遺伝子クラスターにつながる抗生物質の同定から単一の手順を説明します。何年も前に私たちは、 大腸菌宿主細胞を形質導入し、ファージにそれらをパッケージ化、コスミドライブラリーをクローニングし、polyketomycinクラスタの重複領域を有するクローンを同定するためにコロニーの数千人を選別しなければなりませんでした。コスミドの配列決定も困難と高価なプロセス12でした。 株にさらなる研究を行うために、我々は、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028の全ゲノム配列を決定しました。ドラフトゲノム配列で、私たちは簡単にpolyketomycinと有望な化合物をコードする他のクラスターの生合成遺伝子クラスターを同定しました。 図7は、コスミドライブラリーと精巧スクリーニングのクローニングにより生合成クラスターを識別する「古い」方法を比較し、粗い時間スケールで、その後のゲノムマイニングと全ゲノム配列決定による「新しい」方法。新しいシーケンシング技術や新ゲノムマイニングプログラムは、全体のプロセスをスピードアップします。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg" /> 図7：生合成遺伝子クラスターの割り当ての「古い」と「新」法の比較。 「古い」方法は、それぞれのコスミド（複数可）（上記）の陽性クローン及び配列の選択とコスミドライブラリーのクローニングを含み、 「新しい」メソッドは、全ゲノム配列決定および系統（以下）のゲノム上に位置する全ての二次代謝産物の遺伝子クラスターを同定するために-miningを含みます。単一ステップの所要時間は大まかな時間スケールで示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

ここでは、抗生物質活性を有する天然物の識別、（B）化合物の精製、（C）は、その生合成の最初のモデル、（D）ゲノムシーケンシング/ -miningと（（A）の詳細なプロトコルを提示しますE）生合成遺伝子クラスターの検証。

からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへ<em&gt;ストレプトミセスdiastatochromogenes</em&gt;Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

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