Name: from a natural product to its biosynthetic gene cluster: a demonstration using polyketomycin from streptomyces diastatochromogenes t&#252;6028
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÂ¼6028 at JoVE.com

S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of T&#252;bingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).

1. Identifiering av en naturlig produkt med antibiotika Property <ol><li> Odla en mikroorganism under olika förhållanden (t.ex. tid, temperatur, pH, media) genom att följa &quot;OSMAC (en stam-många föreningar) approach&quot; 13. Välja ett medium, i vilket framställningen av en förening kan observeras. </li><li> Odla Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 under följande förutsättningar <ol><li> Växa Streptomyces diastatochromogenes Tü6026 påfrestning på MS-plattor (sojamjöl 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, kranvatten 1 L). Ympa en liten ögla av sporer av denna stam i 20 ml flytande TSB-medium (tryptisk sojabuljong 30 g, kranvatten 1 L, pH 7,2; förodling medium) i en Erlenmeyerkolv med en spiral. Skaka kolven på en roterande skakapparat (28 ° C, 180 rpm, 2 dagar). </li><li> Inokulera huvudkultur i 100 ml HA-medium (glukos 4 g, jästextrakt 4 g, maltextrahera 10 g, kranvatten 1 L, pH 7,2) med 2 ml av förkulturen. Kultur töjningen vid 28 ° C under 6 dagar på en roterande skakanordning vid 180 rpm. </li></ol></li><li> Framställning av råextraktet <ol><li> Harvest cellerna genom centrifugering (10 min, 3000 XG). </li><li> För nästa steg hantera organiska lösningsmedel under ett dragskåp. </li><li> För förening extraktion från myceliet, återsuspendera cellerna i en tvåfaldig volym av aceton och skaka i ett rör för 30 min, 180 rpm. Filtrera vätskan genom kommersiell filterpapper och indunsta aceton genom rotationsindunstare vid 40 ° C och 550 bar. Lös upp extraktet i 20 ml vatten: etylacetat (1: 1) och skaka den i en separationstratt under 30 minuter vid 180 rpm. </li><li> För förening extraktion från odlingsmediet, justera odlingsbuljongen till pH 4,0 genom tillsats av 1 M HCl. Tillsätt 100 ml etylacetat och skaka den i en separationstratt under 30 minuter, 180 rpm. </li><li> Samla etylacetatfasen och indunsta av röta<html> ary indunstning vid 40 ° C och 240 bar. </li></ol></li><li> Analys av råextraktet genom HPLC <ol><li> Upplösa extrakt i 1 ml MeOH, filtrera dem genom ett 0,45 ^ m porstorlek filter och köra högpresterande vätskekromatografi (HPLC) 14. </li><li> I fallet med polyketomycin, utrusta i HPLC-systemet med en C18 förkolonn (4,6 x 20 mm 2) och en C18-kolonn (4,6 x 100 mm 2). Använda en linjär gradient av acetonitril + 0,5% ättiksyra som sträcker sig från 20% till 95% i H2O + 0,5% ättiksyra (flödeshastighet: 0,5 ml min -1). OBS: Polyketomycin har en retentionstid av 25,9 min (se figur 1A). UV / synligt spektrum har maxima vid 242 nm, 282 nm, 446 nm och minima vid 262 nm och 359 nm (se figur 1B). I den negativa modus en massa av 863,2 [MH] - kan detekteras (se figur 1C). </li></ol></li></ol>&quot;Src =&quot; / filer / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: LC / MS-analys av Polyketomycin. (A) HPLC-kromatogram (λ = 430 nm) av det råa extraktet efter odling av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 i 6 dagar. Polyketomycin har en retentionstid av 25,9 min (B) UV / synligt spektra för Polyketomycin. (C) Mass-spektra för Polyketomycin nekande modus. Huvudtopp med m / z 863,2 [MH] -. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="5"><li> Identifiering av den antibiotiska aktiviteten med hjälp av skiv diffusion analys <ol><li> Inokulera teststammar såsom grampositiva bakterier Bacillus subtilis (i LB-medium, LB 20 g, kranvatten 1 L, pH 7,4) och andra Streptomyces-stammar (i TSB-medium; tryptisk sojabuljong 30 g, kranvatten 1 L, pH 70,2), gramnegativa bakterier Escherichia coli (i LB-medium) och svampstammar (i media såsom YPD-medium; jästextrakt 10 g, pepton 20 g, glukos 20 g, kranvatten 1 L, pH 7,4). Ta 100 mikroliter av teststammen förodling och sprida dem på respektive agarplattor. </li><li> Lös råextraktet eller renade föreningen i 500 mikroliter av metanol (alternativt vatten eller DMSO) och pipett 20-50 mikroliter på sterila pappersskivor. Torra pappersskivor för 30 minuter under arbetsbänken och sätta dem på plattorna med testkulturerna. Bered en negativ kontroll (lösningsmedel) och en positiv kontroll (antibiotikum, t ex apramycin [1 mg]). </li><li> Inkubera plattorna under tillfredsställande förhållanden tills teststammarna är synligt odlas och bestämma hämningszonen, om uppenbar. Inkubera E. coli och Bacillus sp. vid 37 ° C under 16 h, Streptomyces sp. vid 28 ° C under 2-4 dagar, svampstam (huvudsakligen beroende av exakta teststam) ent 30 ° C under 2 dagar). </li></ol></li></ol> 2. Storskalig Utvinning, rening och struktur Klarläggande av föreningen <ol><li> Odla S. diastatochromogenes i 5 L HA-medium (glukos 4 g, jästextrakt 4 g, maltextrakt 10 g, kranvatten 1 L, pH 7,2). Ympa 2 ml av förkulturen i 30 x 500 ml Erlenmeyerkolvar innehållande 150 ml HA medium. Inkubera töjningen vid 28 ° C under 6 dagar på en roterande skakanordning vid 180 rpm. </li><li> Harvest cellerna genom centrifugering (10 min, 15.000 xg, RT) och extrahera föreningar med användning av etylacetat (se avsnitt 1.3). </li></ol><img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig2.jpg" /> Figur 2: Workflow för struktur Förtydligande. Förfarandet innefattar (1) odling av stammen, (2) extraktion, (3) rening genom fastfas-extraktion (SPE), tunnskiktskromatografi (TLC), preparativ HPLC (HPLC), storlek(SEC) och (4) struktur belysning genom massanalys (MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) och röntgenmätningar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="3"><li> Rening av Polyketomycin OBS: Processen att rening och strukturen belysning visas i figur 2. <ol><li> Fraktionera råextrakt genom en kolonn C18 fastfasextraktion (SPE) med användning av en 10% -stepwise MeOH-gradient som sträcker sig från 30% till 100% MeOH i H2O, 100 ml för varje tillstånd. </li><li> Rena föreningen innehållande fraktionen ytterligare genom preparativ tunnskiktskromatografi (TLC) 15 med användning av CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) som elueringssystem. </li><li> Rena föreningen genom preparativ HPLC 16. Utrusta i HPLC-systemet med en C18 förkolonn (5 pm; 9,4 x 20 mm) och enHuvud kolonn (5 pm; 9,4 x 150 mm). Använda en gradient av acetonitril + 0,5% ättiksyra som sträcker sig från 20% till 95% i H2O + 0,5% ättiksyra (flödeshastighet: 2,0 ml / min). </li><li> För att ta bort lösningsmedel och andra små föroreningar, utför ett sista reningssteg genom storleksexklusionskromatografi med användning av en kolonn i MeOH 17. Samla in den slutliga rena föreningen och indunsta MeOH genom rotationsindunstning vid 40 ° C och 240 bar. </li></ol></li><li> struktur klargörande <ol><li> Lös den rena föreningen (mer än 2 mg) i 600-700 mikroliter (beroende på maskinen) i DMSO 6, rekord 1D NMR (1H, 13 C) och 2D NMR (HSQC, HMBC, en H- 1H COSY) spektra på en NMR-spektrometer 18. Uttrycka kemiska förskjutningar i ö-värden (ppm) med användning av DMSO-d6. </li><li> Spela in en högupplöst masspektrum (HRESI-MS) 19 av polyketomycin med användning av en högupplösandemasspektrometer. </li><li> Klarlägga strukturen genom tolkning av resultaten av NMR- och MS-analys av data 10. </li></ol></li></ol> 3. Att föreslå Biosyntetiska modell av den nya isolerade föreningen <ol><li> Analysera strukturen av den isolerade föreningen och förutsäga enzymer, som kan vara inblandade i dess biosyntes. Tilldela dem till polyketid (typ I, II eller III), icke-ribosomal peptidsyntes, lantipeptide, terpenoid eller socker metabolism vägen 8. </li><li> exempel polyketomycin <ol><li> Dela strukturen i uppenbara enkel delar: tetra del, två monosackarider och dimetyl-salicylsyra. </li><li> Ta reda på, där grupperna kan härledas från: tetra delen kan härledas från en polyketid syntas typ II och dimetyl-salicylsyra delen kan härledas genom en iterativ polyketid syntas typ I. De två sockergrupper, som är 6-deoxysugars , skulle kunna synthesiZed från glukos innebär en TDP-glukos-4,6-dehydratas under biosyntesen och fäst troligen av två glykosyltransferaser (se figur 3) 8. </li><li> Förutsäga förmodade gener i klustret. Tänk på enzymer som är involverade i syntesen av de enskilda delarna, i anslutning enheter, liksom i att modifiera och skräddarsy molekylen. Den biosyntetiska genen kluster av Polyketomycin innehåller sannolikt gener som kodar för en polyketid syntas typ II (därför minst en ACP, KS α und KS β för anslutning extender enheter), en iterativ polyketid syntas typ I (åtminstone ACP, AT, KS), en TDP-glukos-4,6-dehydratas (nödvändigt för steg: glukos → deoxiglukos) och två glykosyltransferaser (förenade två socker monomerer till aglykonen) 8. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig3.jpg" /> Figur 3: Uppbyggnad av Polyketomycin Divided i Single Building Blocks. Polyketomycin är sammansatt av en tetracyklisk decaketid (PKS typ II) och en dimetyl salicylsyra (iterativ PKS typ I), förenade genom de två deoxysugar molekyldelar β-D-amicetose och α-L-axenose (NDP-glukos-4,6- dehydratas och två glykosyltransferas krävs). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 4. Genome Sequencing / Mining <ol><li> Nästa generations sekvense <ol><li> Sekvensera iskt DNA av nästa generations sekvenseringsteknologier som Illumina, 454 Pyrosequencing eller fast 20. Rikta enda läser till en referenssekvens eller montera de novo. OBS! Genomet hos S. diastatochromogenes Tü6028 sekvenserades vid Centrum för bioteknik (CeBiTec) vid University of Bielefeld. Alla läser samlades till ett utkast genompå 7,9 Mb. </li></ol></li><li> genomet mining <ol><li> Sök efter öppna läsramar (ORF) med användning av till exempel NCBI Prokaryot Genome Notering Pipeline 21,22, RAST (snabb anteckning med hjälp av delsystemet teknik) 23,24,25, Prokka (snabb prokaryot genom annotation) 26 eller GenDB 27. Dessa program föreslår också deras funktioner. Analysen av S. diastatochromogenes Tü6028 utkast genomet sekvens ledde till identifieringen av mer än 7000 ORF. </li><li> Kör specifika BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analys för att få mer information som inriktningar med andra liknande gener och katalytiska domänerna 28,29,30. </li><li> För identifiering av de sekundära metabolit genkluster köra program som antiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 och NRPSpredictor 35,36. I utkastet till genomet hos Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 identierad 22 genkluster. </li><li> Analysera de förmodade genkluster för deras enzymatiska vägen (s) (polyketid syntas (typ I, II eller III), icke-ribosomal peptid syntetas, lanthipeptide, terpenoida, socker metabolism ...). Sökning efter modul (er) som innehåller gener som kan vara involverade i syntesen av föreningen (se avsnitt 3). I S. diastatochromogenes kommenterad kluster 2 innehåller polyketid syntas typ II-gener, tre polyketid syntas typ I-gener, en TDP-glukos-4,6-dehydratas genen och två glykosyltransferasaktiviteter gener (se Figur 4). </li><li> Fokus på enskilda gener i klustret. För PKS typ I och NRPS specificiteten hos acyltransferaser och adenylering domäner, och sålunda inkorporering av enstaka extender enheter, kan förutsägas. jämför också ordningen på den inbyggda extender enhet med molekylen. antiSMASH 31,32,33 visar också liknande kluster av redan kända föreningar, med en länk till MIBiG databas 37. </li&gt; <li> Jämföra strukturen av föreningen med dessa andra föreningar och kontrollera efter likheter. </li></ol></li></ol><img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig4.jpg" /> Figur 4: antiSMASH Produktionen Polyketomycin Biosyntetisk genklustret och översikt av andra kluster i S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Översikt över förväntade biosyntetiska genkluster i genomet hos S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Cluster 2 Polyketomycin biosyntetiska genkluster med riktade gener. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 5. Kontroll av den biosyntetiska Gene Cluster <ol><li> Sök efter en gen med uppenbara och viktiga (väsentliga) funktioner för biosyntes av föreningen. För kontroll av polyketomycin genklustret genen pokPI, som kodar för ketosynthase α från PKS typ II, valdes och inaktiveras genom en av ram -deletion (se figur 5B). Alternativt avbryter genen genom kloning ett internt fragment (se figur 5C). </li></ol><img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig5.jpg" /> Figur 5: Kontroll av en Gene Cluster av Single Crossover. (A) Native gen leder till översättningen av ett funktionellt protein; (B) Kloning av genen med inre deletion i en självmordsvektor leder till en enda överkorsnings vilket resulterar i en ram förskjutning i den målinriktade genen och efterföljande translation av icke-funktionellt protein; (C) Kloning av ett inre fragment av genen in i en självmordsvektor leder till en trunkering av genen och efterföljande translation av ett icke-funktionellt protein. oriT: ursprung tverför; antibiotika R: antibiotikaresistens. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="2"><li> Kloning av single-crossover-konstruktionen <ol><li> Amplifiera ett fragment innehållande pokPI genom PCR 38 med primers pokPI_for och pokPI_rev. </li><li> Klonen PCR-produkten in i självmordsvektorn pKC1132 39 (apramycin R [50 mg / ml]). Självmordsvektorn inte kan replikeras i Streptomyces-stammen och har att integrera i den målinriktade genen genom homolog rekombination för att tillhandahålla apramycin-resistens således. Överför vektorn i E. coli kloning värd genom värmechock omvandling 40. </li><li> Isolera vektorn genom alkalisk lys 41. </li><li> Smälta vektor-DNA med en enda skärrestriktionsenzym som skär inom fragmentet. Den pokPI gene digererades med enzym Kpn I. </li><li> Behandla uppsluten vektor-DNA med stort DNA-polymeras I (Klenow) fragment, som har 5 &#39;→ 3&#39; polymerasaktivitet och 3 &#39;→ 5&#39; exonukleas-aktivitet. Avtrubbning av de klibbiga ändarna och efterföljande återligering leder till förlust av fyra baser. Kontrollera om förlusten av dessa baser vid steg transformation i E. coli XL1 Blue, plocka enstaka kolonier, isolera plasmid-DNA, 41 och analysera ytterligare genom restriktionsklyvning och sekvensering. </li></ol></li><li> Konjugering av enkel crossover konstruktion i Streptomyces <ol><li> Överför självmord vektor innehållande pokPI genen (pKC1132_ pokPI del) med deletion i E. coli ET12567 pUZ8002 42 (kanamycin R) genom värmechock omvandling 40. Inkubera cellerna i 100 ml LB-medium (kanamycin 50 mikrogram ml -1, apramycin 50 mikrogram ml -1 </sup&gt;) Över natten vid 37 ° C. Harvest cellerna genom centrifugering (3000 xg, 10 min, 4 ° C) och tvätta cellerna två gånger genom resuspendering i 50 ml LB-media. Slutligen återsuspendera cellerna i 2 x 500 | il LB-medium. </li><li> Blanda 500 mikroliter E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del med 500 mikroliter Streptomyces diastatochromogenes kultur (alternativt använda sporer). Bred ut blandningen på MS-plattor (sojamjöl 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, kranvatten 1 L). Inkubera plattorna under 20 h vid 28 ° C. </li><li> Overlay varje platta med apramycin (1,25 mg) och fosfomycin (5 mg) upplöst i 1 ml vatten och låt dem torka. Inkubera plattorna under flera dagar vid 28 ° C tills exconjugants är synliga. </li></ol></li><li> Kontrollera single-crossover-mutanter <ol><li> Inokulera enstaka exconjugants i 20 ml TSB-medium (apramycin 50 mg ml -1) och inkubera dem vid 28 ° C under tre dagar och 180 rpm.</li><li> Isolera genomiskt DNA 43 och kontrollera avbrott i pokPI genen genom PCR. </li><li> Inokulera enstaka kloner med verifierad gen avbrott och Streptomyces vildtyp stam i 100 ml HA medium och inkubera dem under 6 dagar vid 28 ° C och 180 rpm. Utdrag råextraktet (se avsnitt 1.3). Kontrollera förening produktion av HPLC-MS-analys (se avsnitt 1.4). Den motsvarande toppen i HPLC-kromatogram och massan av föreningen skall inte kunna detekteras längre (se figur 6). </li></ol></li></ol><img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig6.jpg" /> Figur 6: HPLC-analys av S. diastatochromogenes med Inaktiv pokPI Gene. HPLC-kromatogram (λ = 430 nm) av råextrakt av S. diastatochromogenes WT (överst) och mutantstam med avbruten pokPI -gen (nedan). Den mutanta stammen producerar inte polyketomycin längre.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<ol>
	<li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+antibacterial+action+of+cultures+of+a+penicillin,+with+special+reference+to+their+use+in+isolation+of+B.+influenzae.">On the antibacterial action of cultures of a penicillin, with special reference to their use in isolation of B. influenzae.</a> Br J Exp Pathol. 10 (3), 226-236 (1929).</li><li>Lemke, A., Kiderlen, A. F., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B.">Amphotericin B.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2), 151-162 (2005).</li><li>Kirkpatrick, P., Raja, A., LaBonte, J., Lebbos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daptomycin.">Daptomycin.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 2 (12), 943-944 (2003).</li><li>Zakeri, B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+of+tetracycline+antibiotics.">Chemical biology of tetracycline antibiotics.</a> Biochem. cell Biol. 86 (2), 124-136 (2008).</li><li>Schatz, A., Bugle, E., Waksman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomycin,+a+Substance+Exhibiting+Antibiotic+Activity+Against+Gram-Positive+and+Gram-Negative+Bacteria.">Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.</a> Exp. Biol. Med. 55 (1), 66-69 (1944).</li><li>Burg, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avermectins,+new+family+of+potent+anthelmintic+agents:+producing+organism+and+fermentation.">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 361-367 (1979).</li><li>Egerton, J. R., Ostlind, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avermectins,+new+family+of+potent+anthelmintic+agents:+efficacy+of+the+B1a+component.">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the B1a component.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 372-378 (1979).</li><li>Walsh, C. T., Fischbach, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+version+2.0:+connecting+genes+to+molecules.">Natural products version 2.0: connecting genes to molecules.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (8), 2469-2493 (2010).</li><li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyketomycin,+a+new+antibiotic+from+Streptomyces+sp.+MK277-AF1.+II.+Structure+determination.">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1. II. Structure determination.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 26-32 (1998).</li><li>Paululat, T., Zeeck, A., Gutterer, J. M., Fiedler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+polyketomycin+produced+by+Streptomyces+diastatochromogenes.T&#252;6028.">Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes.T&#252;6028.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 52 (2), 96-101 (1999).</li><li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyketomycin,+a+new+antibiotic+from+Streptomyces.+sp.+MK277-AF1.+I.+Taxonomy,+production,+isolation,+physico-chemical+properties+and+biological+activities.">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces. sp. MK277-AF1. I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 21-25 (1998).</li><li>Daum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organisation+of+the+biosynthetic+gene+cluster+and+tailoring+enzymes+in+the+biosynthesis+of+the+tetracyclic+quinone+glycoside+antibiotic+polyketomycin.">Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin.</a> Chembiochem. 10 (6), 1073-1083 (2009).</li><li>Bode, H. B., Bethe, B., H&#246;fs, R., Zeeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Big+effects+from+small+changes:+possible+ways+to+explore+nature's+chemical+diversity.">Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity.</a> Chembiochem. 3 (7), 619-627 (2002).</li><li>Wolfender, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+in+Natural+Product+Analysis:+The+Detection+Issue.">HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue.</a> Planta Med. 75 (07), 719-734 (2009).</li><li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thin-layer chromatography. A laboratory handbook. , (1967).</li><li>Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+HPLC+Separation.">Preparative HPLC Separation.</a> Pract. HPLC Method Dev. , 616-642 (2012).</li><li>Granath, K. A., Kvist, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+distribution+analysis+by+gel+chromatography+on+sephadex.">Molecular weight distribution analysis by gel chromatography on sephadex.</a> J. Chromatogr. A. 28, 69-81 (1967).</li><li>Jackman, L. M., Sternhell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+in+Organic+Chemistry.">Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Organic Chemistry.</a> Int. Ser. Org. Chem. , (1969).</li><li>Xian, F., Hendrickson, C. L., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+mass+spectrometry.">High resolution mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (2), 708-719 (2012).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+technologies+-+the+next+generation.">Sequencing technologies - the next generation.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (1), 31-46 (2010).</li><li>Tatusova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+Genome+Annotation+Pipeline.">Prokaryotic Genome Annotation Pipeline.</a> NCBI Handb. 2nd Ed. , (2013).</li><li>Angiuoli, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+online+repository+of+Standard+Operating+Procedures+(SOPs)+for+(meta)genomic+annotation.">Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation.</a> OMICS. 12 (2), 137-141 (2008).</li><li>Aziz, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAST+Server:+rapid+annotations+using+subsystems+technology.">The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology.</a> BMC Genomics. 9, 75 (2008).</li><li>Overbeek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SEED+and+the+Rapid+Annotation+of+microbial+genomes+using+Subsystems+Technology+(RAST).">The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST).</a> Nucleic Acids Res. 42, 206-214 (2014).</li><li>Brettin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RASTtk:+a+modular+and+extensible+implementation+of+the+RAST+algorithm+for+building+custom+annotation+pipelines+and+annotating+batches+of+genomes.">RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes.</a> Sci. Rep. 5, 8365 (2015).</li><li>Seemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokka:+rapid+prokaryotic+genome+annotation.">Prokka: rapid prokaryotic genome annotation.</a> Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenDB--an+open+source+genome+annotation+system+for+prokaryote+genomes.">GenDB--an open source genome annotation system for prokaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 31 (8), 2187-2195 (2003).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Madden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BLAST+Sequence+Analysis+Tool.">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> NCBI Handb. 2nd Ed. , (2003).</li><li>Marchler-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDD:+NCBI's+conserved+domain+database.">CDD: NCBI's conserved domain database.</a> Nucleic Acids Res. 43, 222-226 (2014).</li><li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=antiSMASH:+rapid+identification,+annotation+and+analysis+of+secondary+metabolite+biosynthesis+gene+clusters+in+bacterial+and+fungal+genome+sequences.">antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences.</a> Nucleic Acids Res. 39, 339-346 (2011).</li><li>Blin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=antiSMASH+2.0--a+versatile+platform+for+genome+mining+of+secondary+metabolite+producers.">antiSMASH 2.0--a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers.</a> Nucleic Acids Res. 41, 204-212 (2013).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=antiSMASH+3.0+-+a+comprehensive+resource+for+the+genome+mining+of+biosynthetic+gene+clusters.">antiSMASH 3.0 - a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters.</a> Nucleic Acids Res. 43, 237-243 (2015).</li><li>Ziemert, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+product+domain+seeker+NaPDoS:+a+phylogeny+based+bioinformatic+tool+to+classify+secondary+metabolite+gene+diversity.">The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity.</a> PLoS One. 7 (3), 34064 (2012).</li><li>Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W., Huson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+prediction+of+adenylation+domains+in+nonribosomal+peptide+synthetases+(NRPS)+using+transductive+support+vector+machines+(TSVMs).">Specificity prediction of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs).</a> Nucleic Acids Res. 33 (18), 5799-5808 (2005).</li><li>R&#246;ttig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRPSSpredictor2--a+web+server+for+predicting+NRPS+adenylation+domain+specificity.">NRPSSpredictor2--a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39, 362-367 (2011).</li><li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Information+about+a+Biosynthetic+Gene+cluster.">Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster.</a> Nat. Chem. Biol. 11 (9), 625-631 (2015).</li><li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro:+the+polymerase+chain+reaction.">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51, 263-273 (1986).</li><li>Bierman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+cloning+vectors+for+the+conjugal+transfer+of+DNA+from+Escherichia+coli+to+Streptomyces+spp.">Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.</a> Gene. 116 (1), 43-49 (1992).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli.using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli.using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Bimboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA.">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li><li>MacNeil, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Streptomyces+avermitilis.+genes+required+for+avermectin+biosynthesis+utilizing+a+novel+integration+vector.">Analysis of Streptomyces avermitilis. genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.</a> Gene. 111 (1), 61-68 (1992).</li><li>Pospiech, A., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+quick-prep+of+genomic+DNA+from+Gram-positive+bacteria.">A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria.</a> Trends Genet. 11 (6), 217-218 (1995).</li><li>Makitrynskyy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+regulatory+genes+bldA,+adpA+and+absB+are+implicated+in+production+of+phosphoglycolipid+antibiotic+moenomycin.">Pleiotropic regulatory genes bldA, adpA and absB are implicated in production of phosphoglycolipid antibiotic moenomycin.</a> Open Biol. 3 (10), 130121 (2013).</li><li>Kalan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryptic+polyene+biosynthetic+gene+cluster+in+Streptomyces+calvus+is+expressed+upon+complementation+with+a+functional+bldA+gene.">A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene.</a> Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).</li><li>Gessner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+Biosynthetic+Profiles+by+Expressing+bldA+in+Streptomyces+Strains.">Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains.</a> ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In this lab a genomic cosmid library of Streptomyces diastatochromogenes was generated and screened many years ago, resulting in the identification of the polyketomycin gene cluster through an extremely time-consuming process. Characterization of single genes were possible using targeted gene deletions and analysis of the resulting mutants12. Recently, a draft genome sequence of S. diastatochromogenes was obtained allowing the fast identification of the polyketomycin biosynthetic gene cluster. We could easily detect the biosynthetic genes, although the draft genome sequence contains still many contigs. The described process can be achieved within months. However, the procedure comprises many steps. Single steps may fail several times, preventing progression to subsequent steps:
The genus Streptomyces is known for its capacity to produce bioactive compounds. While they carry often more than 20 biosynthetic gene clusters, usually only one or two compounds are produced under laboratory conditions. The application of the OSMAC approach (cultivation of one strain under different conditions) to wake up silent gene clusters may sometimes not be enough. Genetic manipulation of regulatory genes, such as the pleiotropic regulator genes adpA44 and bldA45,46, is also an effective method to activate the production of other secondary metabolites.
For the elucidation of the compound&#39;s structure, e.g. by NMR analysis, usually more than 2 mg of purified compound is necessary. Therefore, fermentation of more than 10 L culture is often required. Without a fermenter that is able to maintain oxygen, pH and temperature conditions, it might be challenging in a small lab to handle this amount of culture and subsequent extraction. During purification, the compound may be changed due to oxidation, radiation or temperature. Also, the more purification steps are used, the higher the chance of degradation.
When analyzing the structure of the natural product, and the clusters in the genome, sometimes it is not that easy to identify the appropriate cluster. Firstly, if there is only a draft genome sequence some part of the cluster may be missing. Secondly, not all genes which are required for the biosynthesis are in the cluster. Thirdly, sometimes a cluster is split into two parts separated from each other by many kilobases. Fourthly, it may be difficult to decide which one is the appropriate gene cluster. In case of large PKS type I or NRPS systems, where it is possible to calculate the number of extender units based on the number of modules, or even identify the single extender units by analysis of the selecting domains, it turns up easily. However, in the case of iteratively working enzymes the prediction of the synthesized compounds is often not possible, especially if the strain has more than 40 gene clusters. Fifthly, nature is highly complex and full of yet unknown compounds. Often the biosynthesis is a mixture of different pathways. If the new compound is not identified yet, or not related to another compound, it may be difficult to identify the cluster, to propose a biosynthesis model and to prove it.
Once the cluster is identified, the single crossover technique is a good and quick method to verify the hypothesis. PCR, cloning into a suicide vector, conjugation, selection of positive clones, and production assay are the only steps required. One disadvantage of this technique is that the integration of the vector into the chromosome is not stable due to further recombination events. Therefore, in order to further analyze single genes, precise gene deletions are required. Also it may be tricky to manipulate Streptomyces strains on the genetic level.
The described procedure can be assigned to any other compound produced by a Streptomyces strain or another microorganism. The knowledge about a biosynthetic gene cluster and its synthesized compound gives us further opportunities to modify already existing molecules with the aim of improving them for the fight against multidrug-resistant pathogens.

Naturliga produkter från växter och mikroorganismer har alltid varit en viktig källa för klinisk läkemedelsutveckling och forskning. Den första antibiotikum Penicillin upptäcktes 1928 från en svamp av Alexander Fleming ett. Numera är många fler naturliga produkter som används i klinisk behandling. Ett släkte känd för sin förmåga att producera olika typer av sekundära metaboliter med olika bioaktiviteter är Streptomyces. Streptomyces är grampositiva bakterier och tillhör klassen av aktinobakterier och ordningen Actinomycetales. Nästan två tredjedelar av de kliniskt använda antibiotika härrör från Actinomycetales, främst från Streptomyces, som amfotericin 2, daptomycin tre eller tetracyklin 4. Två Nobelpris har delats ut inom Streptomyces antibiotikaforskning. Den första gick till Selman Waksman för upptäckten av streptomycin, den första entibiotic effektiva mot tuberkulos. 5 År 2015, som en del av Nobelpriset i fysiologi och medicin, upptäckten av avermektin från S. avermitilis fick också. Avermektin används för behandling av parasitsjukdomar 6,7. Den traditionella metoden för upptäckten av naturliga produkter i mikroorganismer såsom Streptomyces involverar generellt odling av stammen under olika tillväxtbetingelser, samt extraktion och analys av sekundära metaboliter. Bioaktivitetsanalyser (t.ex. analyser för antibakteriell och anticanceraktivitet) utförs för att detektera aktiviteten hos föreningen. Slutligen är föreningen av intresse isoleras och den kemiska strukturen belyses. Strukturerna av naturprodukter ofta består av enskilda delar som bildar komplexa molekyler. Det finns några, men begränsade, stora biosyntetiska vägar som leder till att bygga blockks, som används för biosyntesen av naturliga produkter. De stora biosyntetiska vägar är polyketid vägar, vägar som leder till terpenoider och alkaloider, vägar med hjälp av aminosyror, och vägar som leder till sockerdelar. Varje väg kännetecknas av en uppsättning av specifika enzymer 8. Baserat på strukturen av föreningen, kan dessa biosyntetiska enzymer förutsägas. Numera kan en detaljerad strukturell analys av en förening i kombination med nästa generations sekvensering och bioinformatisk analys bidra till att identifiera den ansvariga biosyntetiska genklustret. Kluster informationen öppnar nya vägar för vidare forskning naturprodukt. Detta inkluderar heterologt uttryck för att öka utbytet av den naturliga produkten, målinriktad förening modifiering av gendeletion eller förändring och kombi biosyntesen med gener från andra vägar. Polyketomycin isolerades oberoende från odlingsbuljong avtvå stammar, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 och Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. Strukturen belysas med NMR och röntgenanalys. Polyketomycin är sammansatt av en tetracyklisk decaketid och en dimetyl salicylsyra, förenade genom de två deoxysugar molekyldelar p-D-amicetose och α-L-axenose. Den visar cytotoxiska och antibiotisk aktivitet, även mot grampositiva multiresistenta stammar såsom MRSA 11. Ett genomiskt kosmidbibliotek från S. diastatochromogenes Tü6028 genererades och screenades för många år sedan. Använda specifik gen sonder polyketomycin genen kluster med en storlek på 52,2 kb, innehållande 41 gener identifierades efter flera månader av intensivt arbete 12. Nyligen var ett utkast till genomsekvens av S. diastatochromogenes erhållna leder till snabb identifiering av polyketomycin biosyntetiska genklustret. I denna översikt, en metod att hjälpa till att idenderrätta en naturlig produkt och belysa dess biosyntetiska genklustret kommer att beskrivas, med hjälp av polyketomycin som ett exempel. Här förklarar vi de enskilda åtgärder som leder från en naturlig produkt till dess biosyntetiska genkluster visas för polyketomycin produceras av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Protokollet innefattar identifiering och rening av en naturlig produkt med antibiotiska egenskaper. Ytterligare strukturanalys och jämförelse med resultat från genombrytning leder till identifieringen av den biosyntetiska genklustret. Detta förfarande kan tillämpas på någon annan förening härledd från en Streptomyces-stam eller någon annan mikroorganism.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1334">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">agar</td>
			<td style="width:397px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">5210.4</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">agarose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6352.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-mannitol&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">LB&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X964.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malt extract&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X976.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peptone&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">soy flour&#160;</td>
			<td style="width:397px;">W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td>Hensec-Vollsoja</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tryptic soy broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">X938.3</td>
			<td>Caso-Bouillon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">yeast extract&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">3738.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetone&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">9372.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:397px;">Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands</td>
			<td>JT-9012-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dichlorofrom&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>1530754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D</td>
			<td style="width:397px;">ARMAR Chemicals, D&#246;ttingen, Switzerland</td>
			<td style="width:231px;">15200.204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Ethyl acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6784.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">6331.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">7342.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">restriction enzymes</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">polymerase&#160;</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment</td>
			<td>Promega GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">apramycin</td>
			<td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany&#160;</td>
			<td style="width:231px;">A7682.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">fosfomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:231px;">P5396-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:231px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Plasmid/Vectors</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pKC1132</td>
			<td style="width:397px;">Bierman et al. 1992</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Primer&#160;</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pokPI_for</td>
			<td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Primer to amplify fragment containing pokPI gene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">pokPI_rev</td>
			<td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Bacterial strains</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td>
			<td></td>
			<td>Gram-positive test strain&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Escherichia coli ET12567 pUZ8002&#160;</td>
			<td>MacNeil et al., 1992</td>
			<td>strain for conjugation&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Escherichia coli XL1 Blue</td>
			<td style="width:397px;">Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td>
			<td colspan="2">Gram-negative test strain + cloning host&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028</td>
			<td style="width:397px;">Paululat et al., 1999</td>
			<td>Polyketomycin producer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Online services</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td>
			<td style="width:397px;">http://antismash.secondarymetabolites.org/</td>
			<td colspan="2">Detection of secondary metabolite gene cluster</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td>
			<td style="width:397px;">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
			<td colspan="2">finds regions of similarity between biological sequences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">GenDB</td>
			<td style="width:397px;">https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)</td>
			<td style="width:397px;">http://mibig.secondarymetabolites.org/</td>
			<td colspan="2">Database of biosyntetic gene clusters</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaPDoS</td>
			<td style="width:397px;">http://napdos.ucsd.edu/</td>
			<td colspan="2">Detection of seconary metabolite gene cluster</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline</td>
			<td style="width:397px;">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NRPSpredictor</td>
			<td style="width:397px;">http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td>
			<td>Detection of NRPS domains</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Prokka (rapid prokaryotic genome annotation)</td>
			<td style="width:397px;">http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">RAST (rapid annotation using subsystems technology)</td>
			<td style="width:397px;">http://rast.nmpdr.org/</td>
			<td>Annotation of ORFs&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">other programs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Chem Station Rev. A.09.03</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td style="width:231px;">Handling program for HPLC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Clone Manager Suite 7</td>
			<td style="width:397px;">Scientific and Educational Software, Cary, USA</td>
			<td style="width:231px;">Designing Cloning Experiment&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Newbler v2.8</td>
			<td style="width:397px;">Roche Diagnostics</td>
			<td>Alignment of sequencing reads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Machines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC/MS</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Autosampler: G1313A</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Column:Xbridge C18 (100 mm &#215; 4.6 mm; Particle size: 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Degasser: G1322A&#160;</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Quarternary pump: G1311A</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Diode array detector (DAD )G1315B (&#955; = 254 nm and 400 nm)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td>
			<td style="width:397px;">Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_heating bath Hei-VAP Value/G3</td>
			<td colspan="2">Heidolph Instruments GmbH &#38; Co.KG, Schwabach, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">_vacuum pump system SC 920 G</td>
			<td>KNF&#160;Global Strategies&#160;AG, Sursee, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">other material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Sephadex LH20</td>
			<td style="width:397px;">GE Healthcare,&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 &#181;m; filter &#216;15 mm)</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL GmbH &#38; Co. KG, D&#252;ren, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td>
			<td style="width:397px;">Waters GmbH, Eschborn, Germany&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacillus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomyces sp.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fungus&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for agar plates add 2 % agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a natural product to its biosynthetic gene cluster: a demonstration using polyketomycin from streptomyces diastatochromogenes t&#252;6028

Streptomyces-stammar är kända för sin förmåga att producera en mängd olika föreningar med olika bioaktiviteter. Odling under olika förhållanden leder ofta till produktion av nya föreningar. Därför är produktions kulturer av stammarna extraherades med etylacetat och de råa extrakten analyserades med HPLC. Vidare är extrakten testas för deras bioaktivitet genom olika analyser. För struktur belysning föreningen av intresse renas genom en kombination av olika kromatografiska metoder. Genome sekvense i kombination med genombrytning möjliggör identifiering av en naturlig produkt biosyntetiska genkluster med olika dataprogram. För att bekräfta att den korrekta genklustret har identifierats, geninaktivering experiment måste utföras. De resulterande mutanterna analyseras med avseende på produktion av den specifika naturliga produkten. När korrekt genklustret har inaktiverats, denstammen skulle misslyckas att framställa föreningen. Arbetsflödet visas för den antibakteriella föreningen polyketomycin produceras av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Cirka tio år sedan, när genomsekvense var fortfarande mycket dyra, kloningen och identifieringen av ett genkluster var en mycket tidskrävande process. Snabb genomsekvense kombination med genombrytning accelererar rättegången mot kluster identifiering och öppnar upp nya sätt att utforska biosyntes och att generera nya naturliga produkter av genetiska metoder. Protokollet som beskrivs i detta dokument kan tilldelas någon annan förening som härrör från en Streptomyces-stam eller en annan mikroorganism.

I denna översikt beskriver vi de enskilda steg från identifiering av ett antibiotikum som leder till dess biosyntetiska genkluster. Många år sedan klonade vi ett kosmidbibliotek, förpackas dem in i fager, transducerade E. coli värdceller, och var tvungen att screena tusentals kolonier för att identifiera de kloner som har överlappande regioner av polyketomycin kluster. Sekvensering av kosmiderna var också en svår och dyr process 12. För att genomföra ytterligare studier på stammen sekvens vi hela genomet hos Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Med förslaget genomsekvensen vi lätt identifieras den biosyntetiska genen kluster av polyketomycin och andra kluster som kodar lovande föreningar. Figur 7 jämför den &quot;gamla&quot; metod för att identifiera den biosyntetiska klustret genom kloning av ett kosmidbibliotek och elaborative screening, ochden &quot;nya&quot; metod hela genomet sekvensering med efterföljande genombrytning på en grov tidsskala. De nya sekvenseringsteknologier och nya genom gruv program påskynda hela processen. <img alt="figur 7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg" /> Figur 7: Jämförelse av den &quot;gamla&quot; och &quot;nya&quot; Method of Tilldela ett biosyntetiskt Gene Cluster. Den &quot;gamla&quot; förfarande innefattar kloning av en kosmid bibliotek med selektion av positiva kloner och sekvensering av respektive kosmid (er) (ovan); Den &quot;nya&quot; metoden innefattar hela genom sekvensering och -mining att identifiera alla sekundära metaboliten genkluster belägna på genomet av stammen (nedan). Varaktighet av enstaka steg visas på en grov tidsskala. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÂ¼6028 at JoVE.com

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll av (A) identifieringen av en naturlig produkt med antibiotisk aktivitet, (B) rening av föreningen, (C) den första modellen av dess biosyntes, (D) genom sekvensering / -mining och ( E) kontroll av den biosyntetiska genklustret.

Från en naturlig produkt till dess biosyntes Gene Cluster: En demonstration Använda Polyketomycin från<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Med hjälp av en GFP-märkta TMEM184A Construct för Bekräftelse av Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Mass Spectrometry-baserad proteomik analyser med hjälp av databasen OpenProt att avslöja nya proteiner översatt från icke-kanoniska öppen läsning ramar

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...