Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par subvention du NIH R01-CA158283 et NSFC accorde à 31.400.726 ZWYW est financé par le programme Jeunes Talents Mille et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31471235 et 81422038). XY est financé par la fondation scientifique post-doctorale de la Chine (2015M571612).

1. Construction d&#39;un échafaudage PUF avec spécificité de liaison à l&#39;ARN personnalisée par PCR en chevauchement <ol><li> Concevoir une série d&#39;amorces de PCR contenant les séquences PUF qui reconnaissent spécifiquement différents nucléotides d&#39;ARN dans chaque position 12 (voir Tableau 1 pour les séquences d&#39;amorces et voir la Figure 1 A pour le code de reconnaissance ARN: PUF). Pour chaque répétitio...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. 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Ce rapport fournit une description détaillée de la conception et la construction de facteurs d&#39;épissage artificiels qui peuvent manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif d&#39;un gène cible. Ce procédé met à profit le mode de liaison unique de l&#39;ARN de PUF répète pour produire un échafaudage de liaison à l&#39;ARN avec une spécificité personnalisée. Il peut être utilisé pour activer ou réprimer épissage. L&#39;étape critique dans ce protocole est la gén...

La plupart des gènes humains subissent Alternative Splicing (AS) pour produire des isoformes multiples avec des activités distinctes, ce qui a considérablement augmenté la complexité du codage du génome 1, 2. AS fournit un mécanisme important pour réguler la fonction des gènes, et il est étroitement régulée par des voies différentes à différents stades cellulaires et de développement 3, 4. Parce que l&#39; épissage misregulation est une cause fréquente de la maladie humaine 5, 6, 7, 8, ciblage régulation de l&#39; épissage devient une voie thérapeutique intéressante. Selon un modèle simplifié de la régulation de l&#39; épissage, comme cela est principalement contrôlée par épissage cis Regulatory -elements (SRE) dans le pré-ARNm qui fonctionnent comme activateurs d&#39;épissage d&#39;exons ou des silencieux de remplacement. thSRE ese recruter spécifiquement divers facteurs protéiques trans -acting ( à savoir les facteurs d&#39;épissage) qui favorisent ou inhibent la réaction d&#39;épissage 3, 9. La plupart des facteurs d&#39;épissage trans -acting ont des domaines de liaison d&#39;ARN spécifiques de séquence distincts pour reconnaître leurs cibles et domaines effecteurs pour contrôler l&#39; épissage. Les exemples sont les membres de la sérine / riche en arginine (SR) de la famille de protéines qui contiennent de l&#39; ARN N-terminaux de reconnaissance motifs (RRMS), qui se lient activateurs d&#39;épissage d&#39; exons, et des domaines RS C-terminaux, qui favorisent l&#39; inclusion de l&#39; exon 10 les plus connus . A l&#39; inverse, hnRNP A1 se lie à des silencieux d&#39;épissage d&#39; exons dans les domaines RRM et inhibe l&#39; inclusion de l&#39; exon à travers un domaine riche en glycine C-terminal 11. L&#39;utilisation de ces configurations modulaires, les chercheurs devraient être en mesure de concevoir des facteurs d&#39;épissage artificiels en combinant un domaine ARN liaison spécifique (RBD) avec différents effecdomaines tor qui activent ou inhibent l&#39;épissage. La clé d&#39;une telle conception consiste à utiliser un RBD qui reconnaît les cibles donné avec une spécificité de liaison d&#39;ARN programmable, qui est analogue au mode de liaison à l&#39;ADN du domaine CONTE. Cependant, la plupart des domaines contiennent des facteurs d&#39;épissage RRM ou K Homologie (KH) natifs, qui reconnaissent des éléments d&#39;ARN courts avec une faible affinité , et donc un manque de reconnaissance prédictive d&#39;ARN-protéine « code » 12. Le RBD des protéines de répétition MPU ( à savoir le domaine PUF) dispose d&#39; un mode de reconnaissance de l&#39; ARN unique, permettant pour la refonte des domaines PUF de reconnaître spécifiquement l&#39; ARN cibles différentes 13, 14. Le domaine PUF canonique contient huit répétitions de trois hélices a, en reconnaissant chacun une base unique dans une cible d&#39;ARN de 8 nt. Les chaînes latérales des acides aminés à certaines positions des secondes liaisons hydrogène spécifiques forment α-hélice avec le bord de Watson-Crick de tLa base d&#39;ARN, qui détermine la spécificité de liaison de l&#39;ARN de chaque répétition ( figure 1A ). Le code pour la reconnaissance par ARN de la répétition PUF est étonnamment simple ( Figure 1A ), permettant la génération de domaines PUF qui reconnaissent toute combinaison possible de 8 bases (examinée par Wei et Wang 15 ). Ce principe de conception modulaire permet la génération d&#39;un Factor d&#39;épissage Engineered (ESF) qui consiste en un domaine PUF personnalisé et un domaine de modulation d&#39;épissage ( c&#39;est-à-dire un domaine SR ou un domaine riche en Gly). Ces ESF peuvent fonctionner comme activateurs d&#39;épissage ou comme inhibiteurs pour contrôler différents types d&#39;événements d&#39;épissage, et ils se sont révélés utiles comme outils pour manipuler l&#39;épissage des gènes endogènes liés à la maladie humaine 16,17 . Par exemple, nous avons construit des ESF de type PUF-Gly pour modifier spécifiquement l&#39;épissage du gène Bcl-x, La conversion de l&#39;isoforme longue anti-apoptotique (Bcl-xL) en isoforme courante pro-apoptotique (Bcl-xS). Le changement du rapport de l&#39;isoforme Bcl-x était suffisant pour sensibiliser plusieurs cellules cancéreuses à de multiples médicaments contre la chimiothérapie anticancéreux 16 , ce qui suggère que ces facteurs artificiels peuvent être utiles en tant que réactifs thérapeutiques potentiels. En plus de contrôler l&#39;épissage avec des domaines effecteurs d&#39;épissage connus ( par exemple, un domaine RS ou Gly), les facteurs PUF modifiés peuvent également être utilisés pour examiner les activités de nouveaux facteurs d&#39;épissage. Par exemple, en utilisant cette approche, nous avons démontré que le domaine C-terminal de plusieurs protéines SR peut activer ou inhiber l&#39;épissage lors de la liaison à différentes régions pré-ARNm 18 , que le motif riche en alanine de RBM4 peut inhiber l&#39;épissage 19 et Le motif riche en proline de DAZAP1 peut améliorer l&#39;épissage 20 , 21 &lt;/ Sup&gt;. Ces nouveaux domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour construire des types supplémentaires de facteurs artificiels pour affiner l&#39;épissage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

Le traitement de la plupart des ARN eucaryotes est médié par des protéines de liaison à l&#39;ARN (RBP) avec des configurations modulaires, y compris un module de reconnaissance d&#39;ARN, qui lie spécifiquement la cible pré-ARNm et un domaine effecteur. Auparavant, nous avons profité du mode unique de liaison de l&#39;ARN du domaine PUF dans le Pumilio humain 1 pour générer un échafaudage de liaison d&#39;ARN programmable, qui a été utilisé pour concevoir divers RBP artificiels pour manipuler le métabolisme de l&#39;ARN. Ici, un protocole détaillé est décrit pour construire Engineered Splicing Factors (ESF) qui sont spécifiquement conçus pour moduler l&#39;épissage alternatif des gènes cibles. Le protocole comprend la façon de concevoir et de construire un échafaudage PUF personnalisé pour une cible d&#39;ARN spécifique, comment construire un plasmide d&#39;expression ESF en fusionnant un domaine PUF concepteur et un domaine effecteur, et comment utiliser les ESF pour manipuler l&#39;épissage des gènes cibles. Dans les résultats représentatifs de cette méthode, nous avons également décrit les tests communsDes activités du FSE en utilisant les journalistes d&#39;épissage, l&#39;application du FSE dans les cellules humaines cultivées et l&#39;effet subséquent des changements d&#39;épissage. En suivant les protocoles détaillés dans ce rapport, il est possible de concevoir et de générer des ESF pour la régulation de différents types d&#39;épissage alternatif (AS), en fournissant une nouvelle stratégie pour étudier la régulation de l&#39;épissage et la fonction des différentes isoformes d&#39;épissage. De plus, en fusionnant différents domaines fonctionnels avec un domaine PUF conçu, les chercheurs peuvent concevoir des facteurs artificiels qui ciblent des ARN spécifiques pour manipuler diverses étapes du traitement de l&#39;ARN.

Ce rapport décrit le protocole complet pour la conception et la construction de journalistes et de sociétés d&#39;ingénierie épissage. Il présente également la nouvelle application de SESF manipuler l&#39;AS de gènes endogènes 16. Pour illustrer les résultats typiques des changements d&#39;épissage FSE médiation, nous utilisons les données de nos travaux antérieurs à titre d&#39;exemple. SESF avec différents domaines fonctionnels peuvent être util...

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Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ce rapport décrit une méthode de bio-ingénierie pour concevoir et construire de nouveaux Facteurs d&#39;épissage artificiel (ASF) qui modulent spécifiquement l&#39;épissage des gènes cibles dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut être élargie pour englober divers facteurs artificiels pour manipuler d&#39;autres aspects du métabolisme de l&#39;ARN.

Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif dans les cellules humaines

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Recherche

Génétique

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Les dosages de SINEUP Non-coding RNAs qui peuvent améliorer spécifiquement la traduction de l’ARNm de base de cellules

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Génie génétique de Dictyostelium discoideum basés sur la sélection et la croissance sur les bactéries

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Arn artificiel Polymerase II Elongation Complexes pour disséquer les événements de traitement de l'ARN cotranscriptionnel

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...