Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01-CA158283 ו NSFC מענק 31400726 ל ZWYW ממומן על ידי תוכנית הכשרונות צעירים אלף הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מעניקה 31471235 ו 81422038). XY ממומן על ידי קרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (2015M571612).

1. בניית פיגום PUF עם מותאם RNA מחייב ספציפיות ידי חופפים PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עליו להגדיר שורה של פריימרים PCR המכילים רצפי PUF שמזהים נוקלאוטידים RNA שונים במיוחד בכל עמדה 12 (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר ראה איו...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li><li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+day+in+the+life+of+the+spliceosome.">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li><li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics.">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li><li>Wang, G. -. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+disease:+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery.">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li><li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease.">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li><li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine/serine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing.">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li><li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer.">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li><li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA:+is+there+a+code+for+recognition.">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li><li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio/FBF+(PUF)+RNA-binding+domains.">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li><li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nyg&#229;rd, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins.">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li><li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities.">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li><li>Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities.">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li><li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities.">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis.">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li><li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intronic+splicing+enhancers,+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules.">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li><li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK/Erk-regulated+cell+proliferation+and+migration.">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements.">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li><li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control.">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer.">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li><li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer.">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).</li><li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer:+pathways+and+programs+unhinged.">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li><li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer.">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Anczuk&#242;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer.">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li></ol>

דוח זה מספק תיאור מפורט לתכנון ובנייה של גורמים שחבור מלאכותי שיכולים לתמרן במיוחד את השחזור האלטרנטיבי של הגן היעד. שיטה זו מנצלת את מצב מחייב RNA ייחודי של PUF חוזר לייצר RNA מחייב פיגום עם סגוליות אישית. זה יכול לשמש או להפעיל או לדכא שחבור. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

רוב הגנים האנושיים עוברים רישוי אלטרנטיבי (AS) כדי לייצר מספר איסופורמים עם פעילויות נפרדות, אשר הגדילו מאוד את המורכבות של קידוד הגנום 1 , 2 . AS מספקת מנגנון מרכזי להסדרת תפקוד הגן, והוא מוסדר בחוזקה באמצעות מסלולים מגוונים בשלבים שונים של ההתפתחות הסלולרית והתפתחותית 3 , 4 . בגלל שחילוף שגוי הוא גורם שכיח למחלות אנוש 5 , 6 , 7 , 8 , מיקוד שחבור תקנה הופך נתיב טיפולי אטרקטיבי. על פי מודל פשוט של רגולציה שחבור, AS נשלטת בעיקר על ידי שחבור רגולטורית CIS- אלמנטים (SREs) ב מראש mRNA שפועלים כמו משפרי שיפורים או משתיקי קול של אקסונים חלופיים. תEse SREs מגייסים באופן ספציפי גורמים שונים לחילוק גורמים לחילופין ( כלומר, גורמים שחבור) המקדמים או מדכאים את התגובה לחבור 3 , 9 . רוב transact גורמים שחבור יש רצף נפרד ספציפי RNA מחייב תחומים לזהות את המטרות שלהם תחומים אפקט לשלוט שחבור. הדוגמאות המפורסמות ביותר הן בני משפחת החלבון של SRine / arginine, המכילים מוטיבות זיהוי RNA (RRM) N-Terminal RNMs, המחייבים חיבורי שחבור אקסוני ותחנות RS-Term-RS, המקדמים את אקסון הכללה 10 . לעומת זאת, hnRNP A1 נקשר לשתיקי שחיקה אקזוטיים באמצעות דומיינים של RRM ומעכב הכללת אקסון באמצעות תחום C-Termin-glycine עשיר 11 . באמצעות תצורות מודולריות כאלה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להנדס גורמים שחבור מלאכותי על ידי שילוב של RNA ספציפי מחייב תחום (RBD) עם effec שוניםתחומים המפעילים או מעכבים שחבור. המפתח של עיצוב כזה הוא להשתמש RBD שמזהה מטרות נתון עם RNA לתכנות ספציפיות מחייב, אשר מקביל למצב מחייב DNA של תחום הסיפור. עם זאת, רוב הגורמים שחבור ילידים מכילים RRM או K הומולוגיה (KH) תחומים, אשר לזהות אלמנטים קצרים RNA עם זיקה חלשה ולכן חסר ניבוי RNA חלבון הכרה &quot;קוד&quot; 12 . RBD של חלבונים PUF חוזרים ( כלומר תחום PUF) יש מצב הכרה ייחודית RNA, המאפשר לעצב מחדש של תחומים PUF לזהות באופן ספציפי מטרות RNA שונים 13 , 14 . תחום PUF הקנוני מכיל שמונה חזרות של שלושה α-סלסלות, שכל אחת מהן מזהה בסיס בודד ביעד RNA 8-nt. שרשראות הצד של חומצות אמינו בתנוחות מסוימות של השני α- סליל טופס קשרי מימן ספציפיים עם הקצה ווטסון קריק של tהוא RNA בסיס, אשר קובע את הספציפיות RNA מחייב של כל חוזר (איור 1A). הקוד להכרת בסיס RNA של חוזרי PUF הוא פשוט להפליא (איור 1A), המאפשר את הדור של תחומי PUF שמזהים כל שילוב 8-בסיס אפשרי (נבדק על ידי ויי ו וואנג 15). עיקרון עיצוב המודולרי מאפשר לדור של גורם שחבור Engineered (ESF) שמורכב תחום PUF ומותאם תחום אפנון שחבור (כלומר תחום SR או תחום גלאי עשירי). ESFs אלה יכול לשמש גם ממריצי שחבור או כמו מעכבים לשלוט סוגים שונים של אירועי שחבור, והם הוכיחו שימושים ככלים כדי לתפעל את השחבור של גני אנדוגניים הקשורים למחלות אנושיות 16, 17. כדוגמה, בנינו PUF-גלאי-סוג ESFs לשנות את שחבור במיוחד של הגן Bcl-x, המרת איזופורם ארוך אנטי אפופטוטיים (Bcl-XL) כדי איזופורם קצר פרו-אפופטוטיים (Bcl-XS). העברת היחס של איזופורם Bcl-x הייתה מספיק כדי לרגש תאי מספר סרטן לתרופות כימותרפיות אנטי-סרטני מרובות 16, דבר המצביע על כך גורמים המלאכותיים אלה עשויים להיות שימושיים כמו ריאגנטים טיפולי פוטנציאל. בנוסף לשליטת שחבור עם תחומי מפעיל שחבור ידועים (למשל, תחום RS או גלאי עשירי), גורמי PUF המהונדסים יכולים לשמש גם כדי לבחון את פעילות גורמי שחבור חדשים. לדוגמא, באמצעות גישה זו, אנו הוכחנו כי תחום C- מסוף של חלבונים כמה SR יכול להפעיל או לעכב שחבור כאשר מחייבים לאזורים תעתיקי רנ&quot;א ראשוני שונים 18, כי המוטיב עשיר-אלנין של RBM4 יכול לעכב שחבור 19, וכי מוטיב עשיר פרולין של DAZAP1 יכול לשפר שחבור 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. תחומים פונקציונליים חדשים אלה יכולים לשמש לבניית סוגים נוספים של גורמים מלאכותיים שחבור לכוונן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

העיבוד של רוב RNAs איקריוטיים מתווכת על ידי RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם תצורות מודולרי, כולל מודול הכרה RNA, אשר דווקא נקשר היעד הרנ&quot;א הראשוני תחום מפעיל. בעבר, נקטנו היתרון של מצב מחייב רנ&quot;א ייחודי של תחום PUF ב האנושי Pumilio 1 כדי ליצור פיגום לתכנות RNA מחייב, אשר שימש מהנדס RBPs מלאכותית שונים כדי לתפעל את חילוף החומרים RNA. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבנות גורמי שחבור Engineered (ESFs), אשר תוכננו במיוחד כדי לווסת את השחבור החלופי של גני המטרה. הפרוטוקול כולל איך לתכנן ולבנות פיגום PUF אישית עבור מטרה RNA ספציפי, כיצד לבנות פלסמיד ביטוי ESF ידי פיוזינג תחום PUF מעצב תחום מפעיל, וכיצד להשתמש ESFs לתפעל את שחבור של גני מטרה. בתוצאות הנציג של שיטה זו, יש לנו גם תארו את המבחנים הנפוציםפעילויות ESF באמצעות כתבי שחבור, היישום של ESF בתאים אנושיים בתרבית, ואת ההשפעה הבאה של שינויי שחבור. על ידי ביצוע פרוטוקולים מפורטים בדוח זה, אפשר לעצב וליצור ESFs להסדרת סוגים שונים של שחבור חלופי (AS), מתן אסטרטגיה חדשה ללמוד תקנה שחבור והפונקציה של isoforms שחבור שונים. יתר על כן, על ידי פיוזינג תחומים פונקציונליים שונים עם תחום PUF מעוצב, חוקרים יכולים להנדס גורמים מלאכותיים כי למקד RNAs הספציפי כדי לתפעל צעדים שונים של עיבוד RNA.

דו&quot;ח זה מתאר את הפרוטוקול המלא לתכנון והבנייה של ESFs וכתבי שחבור. זה גם מתאר את היישום הנוסף של ESFs לעשות מניפולציה של AS של גני אנדוגניים 16. כדי להמחיש את תוצאות טיפוסיות של שינויי שחבור בתיווך ESF, אנחנו משתמשים בנתונים מהעבודה הקודמת של?...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

דו&quot;ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...