Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01-CA158283 e NSFC concedere 31.400.726 di ZWYW è finanziato dal programma Talents Giovani Mille e la National Science Foundation naturali della Cina (borse di studio 31471235 e 81422038). XY è finanziato dalla fondazione post-dottorato di scienza della Cina (2015M571612).

1. Costruzione di un impianto PUF con specificità di legame RNA personalizzato mediante sovrapposizione di PCR <ol><li> Progettare una serie di primer di PCR contenenti le sequenze PUF che riconoscono in modo specifico diversi nucleotidi di RNA in ciascuna posizione 12 (vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer e vedere la Figura 1A per il codice di riconoscimento RNA: PUF). Per ogni ripetizione PUF, progettare quattro diversi primer per ricon...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements.">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li><li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control.">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer:+pathways+and+programs+unhinged.">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li><li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer.">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Anczuk&#242;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer.">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li></ol>

Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata per la progettazione e la costruzione di fattori di splicing artificiali che possono specificatamente manipolare splicing alternativo di un gene bersaglio. Questo metodo sfrutta la modalità di legame dell&#39;RNA unico PUF ripete per produrre un ponteggio RNA-binding con specificità personalizzato. Può essere utilizzato per attivare o reprimere splicing. Il passaggio critico in questo protocollo è la generazione del dominio PUF reprogr...

La maggior parte dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS) per produrre molteplici isoforme con attività distinte, che ha notevolmente aumentato la complessità di codifica del genoma 1, 2. AS fornisce un meccanismo importante per regolare la funzione del gene, ed è strettamente regolata attraverso percorsi diversi in diverse fasi cellulari e dello sviluppo 3, 4. Perché splicing misregulation è una comune causa di malattie umane 5, 6, 7, 8, il targeting regolamentazione splicing sta diventando un percorso terapeutico attraente. Secondo un modello semplificato di regolazione di splicing, AS è controllata principalmente mediante splicing Regulatory cis -Elementi (SRE) in pre-mRNA che funziona come enhancers splicing o silenziatori di esoni alternativi. thEse SRE specificamente reclutano vari fattori proteici trans- attivi ( cioè fattori di splicing) che promuovono o sopprimono la reazione di splicing 3 , 9 . La maggior parte dei fattori di splicing trans- attivi dispongono di domini specifici di sequenza RNA specifici di sequenza per riconoscere i loro obiettivi e domini effettivi per controllare la splicing. Gli esempi più noti sono i membri della famiglia di proteine ​​ricca di serina / arginina (SR) che contengono N-terminali RNA Recognition Motifs (RRMs) che legano gli enzimi di splicing esoni e domini RS-terminali RS che promuovono l&#39;inclusione di esone 10 . Al contrario, hnRNP A1 si lega ai silenziatori esogeni di splicing attraverso i domini RRM e inibisce l&#39;inclusione di esone attraverso un dominio C-terminale ricco di glicina 11 . Utilizzando tali configurazioni modulari, i ricercatori dovrebbero essere in grado di progettare fattori di splicing artificiali combinando un determinato dominio RNA-binding (RBD) con differenti effecDomini che attivano o inibiscono lo splicing. La chiave di un tale progetto è quella di utilizzare un RBD che riconosca determinati target con specificità di legame di RNA programmabile, che è analogo al modo di legame del DNA del dominio TALE. Tuttavia, la maggior parte dei fattori naturali di splicing contengono domini RRM o K Homology (KH), che riconoscono elementi di RNA corti con debole affinità e quindi non dispongono di un &quot;codice&quot; di riconoscimento di proteine ​​RNA predittivo 12 . Il RBD delle proteine ​​di ripetizione PUF ( ovvero il dominio PUF) ha una modalità di riconoscimento RNA unico, consentendo la ridefinizione dei domini PUF per riconoscere in modo specifico diversi target RNA 13 , 14 . Il dominio PUF canonico contiene otto ripetizioni di tre α-eliche, ciascuno riconoscendo una singola base in un target RNA a 8 nt. Le catene laterali di amminoacidi in determinate posizioni della seconda elica a forma di legami idrogeno specifici con il bordo di Watson-CrickBase RNA, che determina la specificità di binding di RNA di ogni ripetizione ( Figura 1A ). Il codice per il riconoscimento base di RNA della ripetizione del PUF è sorprendentemente semplice ( Figura 1A ), consentendo la generazione di domini PUF che riconoscono qualsiasi possibile combinazione di 8 basi (riesaminate da Wei e Wang 15 ). Questo principio di progettazione modulare consente la generazione di un Fattore di Splicing Engineered (ESF) costituito da un dominio PUF personalizzato e da un dominio di modulazione di splicing ( cioè un dominio SR o un dominio ricco di Gly). Questi ESF possono funzionare come attivatori di splicing o come inibitori per controllare vari tipi di eventi di splicing e si sono dimostrati utili come strumenti per manipolare la splicing di geni endogeni legati alla malattia umana 16 , 17 . Ad esempio, abbiamo costruito ESF di tipo PUF-Gly per alterare in modo specifico la splicing del gene Bcl-x, Convertendo la lunga isoforma anti-apoptotica (Bcl-xL) per il pro-apoptotica breve isoforma (Bcl-XS). Spostando il rapporto tra la Bcl-x isoforma era sufficiente per sensibilizzare varie cellule tumorali a più farmaci chemioterapici anti-cancro 16, suggerendo che questi fattori artificiali possono essere utili come potenziali reagenti terapeutici. Oltre a controllare splicing con noti domini effettori splicing (ad esempio, un RS o Gly-ricca dominio), i fattori ingegnerizzati PUF possono anche essere utilizzati per esaminare le attività dei nuovi fattori di splicing. Ad esempio, utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che il dominio C-terminale di diverse proteine SR può attivare o inibire splicing quando associa alle regioni differenti 18 pre-mRNA, che il motivo ricco-alanina di RBM4 può inibire splicing 19, e che il motivo ricco di prolina di DAZAP1 può migliorare splicing 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Questi nuovi domini funzionali possono essere usati per costruire altri tipi di fattori artificiali per perfezionare splicing.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

Il trattamento della maggior parte RNA eucariotici è mediata da RNA Binding Proteins (RBPs) con configurazioni modulari, tra cui un modulo di riconoscimento di RNA, che si lega specificamente al bersaglio pre-mRNA e un dominio effettore. In precedenza, abbiamo preso vantaggio della modalità di legame dell&#39;RNA unica del dominio PUF in pumilio umano 1 per generare un ponteggio programmabile vincolante RNA, che è stato utilizzato per progettare vari RBPs artificiali per manipolare il metabolismo dell&#39;RNA. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per costruire fattori di splicing Engineered (ESFS) che sono specificamente progettati per modulare lo splicing alternativo di geni bersaglio. Il protocollo comprende come progettare e costruire un ponteggio PUF personalizzato per uno specifico bersaglio RNA, come costruire un plasmide di espressione FSE fondendo un designer dominio PUF e un dominio effettore, e come utilizzare ESFS per manipolare lo splicing di geni bersaglio. Nei risultati rappresentativi di questo metodo, abbiamo anche descritto i saggi comuniDelle attività di ESF che utilizzano reporter di splicing, l&#39;applicazione di ESF nelle cellule umane colte e l&#39;effetto successivo di cambiamenti di splicing. Seguendo i protocolli dettagliati in questa relazione, è possibile progettare e generare ESF per la regolazione di diversi tipi di Splicing Alternativo (AS), fornendo una nuova strategia per studiare la regolazione di splicing e la funzione di diverse isoforme di splicing. Inoltre, fondendo diversi domini funzionali con un dominio PUF progettato, i ricercatori possono progettare fattori artificiali che mirano a specificare gli RNA per manipolare varie fasi di elaborazione RNA.

Questo rapporto descrive il protocollo completo per la progettazione e la costruzione di ESF e reporter di splicing. Descrive anche l&#39;ulteriore applicazione dei FSE nella manipolazione dell&#39;AS dei geni endogeni 16 . Per illustrare i risultati tipici delle modifiche di splicing mediate da ESF, utilizziamo i dati del nostro lavoro precedente come esempio. I FSE con differenti domini funzionali possono essere utilizzati per promuovere o inibire l&#39;inclusio...

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Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell&#39;RNA.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cell Based Assays di Non-codificazione RNAs che specificamente può migliorare la traduzione degli mRNA aumentandone

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Ingegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...