Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

이 작품은 NIH 보조금 R01-CA158283 및 NSFC에 의해 ZWYW에 31,400,726는 젊은 천 인재 프로그램 및 국립 자연 과학 중국의 재단 (보조금 31471235 및 81422038)에 의해 자금 지원 허용 지원되었다. XY 중국의 박사후 과학 재단 (2015M571612)에 의해 지원된다.

사용자 정의와 PUF 비계 1. 건설 PCR 겹치는에 의해 특이성을 RNA가 결합 <ol><li> 즉 각 위치 (12) (: PUF 인식 코드 프라이머 서열은 표 1을 참조하고, RNA는 그림 1 A 참조) 다른 RNA 뉴클레오티드를 인식 PUF 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 디자인 시리즈. 각 PUF 반복, 디자인 네 가지 프라이머는 각각의 위치에 다른 기본을 인식합니다. ...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li><li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+day+in+the+life+of+the+spliceosome.">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li><li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics.">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li><li>Wang, G. -. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li><li>Graveley, B. 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C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis.">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li><li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intronic+splicing+enhancers,+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules.">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li><li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK/Erk-regulated+cell+proliferation+and+migration.">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements.">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li><li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control.">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer.">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li><li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer.">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).</li><li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer:+pathways+and+programs+unhinged.">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li><li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer.">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Anczuk&#242;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer.">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li></ol>

이 보고서는 구체적으로 표적 유전자의 대체 스 플라이 싱을 조작 할 수있는 인공 접합 요소의 설계 및 구성에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이 방법은 사용자의 특이성을 갖는 RNA 결합 골격을 생성하기 위해 반복 PUF의 고유 모드 RNA 결합을 이용한다. 그것은 중 하나를 활성화하거나 접합을 억제하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 핵심 단계는 ESFs의 특이성을 정의 r...

대부분의 인간 유전자는 스 플라이 싱 (AS)가 크게 게놈 (1, 2)의 부호화 복잡도를 증가 구별 활동 여러 이성체를 제조 겪는다. AS는 유전자의 기능을 조절하는 주요 메커니즘을 제공하며, 밀접 다른 셀룰러 및 발달 단계 3, 4에서 다양한 경로를 통해 조절된다. 접합 misregulation 인간의 질병 5, 6, 7, 8의 일반적인 원인이기 때문에, 접합 규제를 대상으로하는 것은 매력적인 치료 경로가되고있다. 주로 접합 촉진제 또는 대체 엑손 소음기로서 기능 mRNA의 사전에 규정 -Elements 시스 접합 (SRES)에 의해 제어되는 바와 같이, 스플 라이스 규제의 간략화 모델에 따라. 목SREs는 스 플라이 싱 반응을 촉진 또는 억제하는 다양한 트랜스 - 작용 단백질 인자 ( 즉, 스 플라이 싱 인자)를 구체적으로 모집한다 3 , 9 . 대부분의 trans- acting splicing factor는 splicing을 제어하기 위해 타겟과 이펙터 도메인을 인식하기 위해 별도의 서열 특이 적 RNA 결합 도메인을 가지고 있습니다. 가장 잘 알려진 예는 exon splicing enhancer를 결합하는 N- 말단 RNA 인식 모티프 (RRMs) 및 엑손 삽입을 촉진시키는 C- 말단 RS 도메인을 포함하는 세린 / 아르기닌이 풍부한 (SR) 단백질 군의 구성원이다 . 반대로, hnRNP A1은 RRM 도메인을 통해 엑소닉 스 플라이 싱 사일런서에 결합하고 C- 말단 글리신이 풍부한 도메인을 통해 엑손 삽입을 억제한다. 이러한 모듈 형 구성을 사용하여 연구자는 서로 다른 효과를 갖는 특정 RNA 결합 도메인 (RBD)을 결합함으로써 인공적인 접합 인자를 조작 할 수 있어야한다활성화 도메인을 TOR 또는 접합을 억제. 이러한 설계의 핵심은 동화 영역의 DNA 결합 모드 유사 프로그램 RNA 결합 특이성과 함께 대상을 인식하는 소정의 RBD를 사용하는 것이다. 그러나, 대부분의 천연 스플 라이스 인자는 RRM을 포함하거나 이와 친 화성이 약하고 짧은 RNA 요소를 인식하고 K 동성 (KH) 도메인, 예측 RNA 단백질 인식 &quot;코드&quot;(12)이 부족하다. PUF 반복 단백질의 RBD는 (즉, PUF 도메인) (14), 특히 다른 RNA를 인식하는 PUF 도메인의 재 설계를 허용, 독특한 RNA 인식 모드가 13 목표로하고있다. 정규 PUF 도메인은 각각 8 NT의 RNA 표적의 단일 염기를 인식하는 세 개의 α 나선 여덟 반복을 포함한다. t의 왓슨 - 크릭 가장자리 번째 α 나선 형태 특정 수소 결합의 특정 위치에서 아미노산의 측쇄그는 각각의 반복 ( 그림 1A )의 RNA 바인딩 특이성을 결정 RNA베이스. PUF 반복의 RNA 염기 인식을위한 코드는 놀라 울 정도로 간단하며 ( Figure 1A ), 가능한 8 염기 조합을 인식하는 PUF 도메인을 생성 할 수 있습니다 (Wei and Wang 15 ). 이 모듈 형 설계 원리는 맞춤화 된 PUF 도메인과 접합 변조 도메인 ( 예 : SR 도메인 또는 Gly- 풍부한 도메인)으로 구성된 공학적 접합 요소 (ESF)를 생성 할 수있게합니다. 이 ESFs는 스 플라이 싱 액티베이터 (splicing activator) 또는 다양한 유형의 스 플라이 싱 이벤트를 제어하기위한 억제제로서 기능 할 수 있으며, 인간 질병과 관련된 내인성 유전자의 스 플라이 싱을 조작하는 도구로서 유용하다. 예를 들어, Bcl-x 유전자의 스 플라이 싱을 구체적으로 변경하기 위해 PUF-Gly- 유형 ESF를 구축했다(Bcl-xL)을 프로 - 아폽토시스 (pro-apoptotic) 단 이소성 형태 (Bcl-xS)로 전환시키는 것을 특징으로하는 방법. Bcl-x isoform의 비율을 바꾸는 것은 여러 가지 암 세포를 여러 항암 화학 요법 약물에 민감하게 만들기에 충분했으며, 이러한 인공 인자가 잠재적 인 치료 시약으로 유용 할 수 있음을 시사한다. 공지 된 스 플라이 싱 이펙터 도메인 ( 예 : RS 또는 Gly- 리치 도메인)으로 스 플라이 싱을 제어하는 ​​것 외에도, 설계된 PUF 인자를 사용하여 새로운 스 플라이 싱 인자의 활성을 조사 할 수있다. 예를 들어,이 접근법을 사용하여 여러 SR 단백질의 C 말단 도메인이 다른 pre-mRNA 영역 18에 결합 할 때 접합을 활성화하거나 억제 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. RBM4의 알라닌이 풍부한 주제는 접합 19 를 억제 할 수 있고, DAZAP1의 프롤린이 풍부한 모티프는 스 플라이 싱을 향상시킬 수있다 20 , 21 &lt;/ sup&gt;. 이러한 새로운 기능 영역은 추가적인 유형의 인위적 요인을 구성하여 접합을 미세 조정할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

대부분의 진핵 생물 RNA의 프로세싱은 pre-mRNA target과 effector domain을 특이 적으로 결합시키는 RNA 인식 모듈을 포함하여 모듈 형 배열을 갖는 RNA Binding Protein (RBP)에 의해 매개된다. 이전에 우리는 인간 Pumilio 1의 PUF 도메인의 고유 한 RNA 결합 모드를 이용하여 RNA 신진 대사를 조작하기 위해 다양한 인공 RBP를 설계하는 프로그래밍 가능한 RNA 바인딩 스캐 폴드를 생성했습니다. 여기에는 세부적인 프로토콜이 구체적으로 표적 유전자의 선택적인 접합을 조절하도록 설계된 공학적 접합 인자 (ESF)를 구축하기 위해 기술되어있다. 이 프로토콜에는 특정 RNA 표적을위한 맞춤화 된 PUF 스캐 폴드를 설계하고 구성하는 방법, 디자이너 PUF 도메인과 이펙터 도메인을 융합시켜 ESF 발현 플라스미드를 구축하는 방법 및 ESF를 사용하여 표적 유전자의 접합을 조작하는 방법이 포함됩니다. 이 방법의 대표 결과에서, 우리는 또한 일반적인 assays를 설명했다스 플라이 싱 리포터를 사용한 ESF 활동, 배양 된 인간 세포에서의 ESF의 적용 및 스 플라이 싱 변화의 후속 효과. 이 보고서의 상세한 프로토콜을 따르면, 다른 유형의 Alternative Splicing (AS)의 조절을위한 ESF를 설계하고 생성 할 수 있으며, 접합 조절 및 다른 접합 이형의 기능을 연구하기위한 새로운 전략을 제공합니다. 또한, 설계된 PUF 영역과 다른 기능 영역을 융합시킴으로써 연구원은 RNA 공정의 다양한 단계를 조작하기 위해 특정 RNA를 표적으로하는 인공 인자를 설계 할 수있다.

이 보고서는 ESF 및 접합 기자의 설계 및 구성을위한 전체 프로토콜을 설명합니다. 또한 내인성 유전자의 AS 조작에있어 ESF의 추가 적용에 대해 설명한다. ESF 매개 스 플라이 싱 변경의 전형적인 결과를 설명하기 위해 이전 연구의 데이터를 예로 사용합니다. 상이한 기능성 영역을 갖는 ESF는 표적 카세트 엑손 ( 도 1D 및 E )의 ?...

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Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

셀 기반 비 코딩 RNAs 특히 mRNA 번역을 향상 시킬 수 있는 SINEUP의 분석 실험

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...