Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH R01-CA158283 и грантом 31400726 NSFC для ZWYW, финансируется Программой талантов молодых тысяч и Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 31471235 и 81422038). XY финансируется научным фондом постдокторантов Китая (2015M571612).

1. Строительство ППЫ строительных лесов с настраиваемым РНКОМ-специфичности связывания с помощью перекрывающего ПЦРА <ol><li> Дизайн серии ПЦР - праймеров , содержащих PUF последовательности , которые специфически распознают различные нуклеотиды РНК в каждой позиции 12 (см <stron...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li><li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+day+in+the+life+of+the+spliceosome.">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li><li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics.">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li><li>Wang, G. -. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+disease:+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery.">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li><li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease.">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li><li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine/serine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing.">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li><li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer.">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li><li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA:+is+there+a+code+for+recognition.">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li><li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio/FBF+(PUF)+RNA-binding+domains.">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li><li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nyg&#229;rd, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins.">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li><li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities.">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li><li>Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities.">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li><li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities.">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis.">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li><li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intronic+splicing+enhancers,+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules.">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li><li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK/Erk-regulated+cell+proliferation+and+migration.">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements.">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li><li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control.">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer.">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li><li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer.">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).</li><li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer:+pathways+and+programs+unhinged.">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li><li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer.">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Anczuk&#242;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer.">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li></ol>

Этот отчет содержит подробное описание для проектирования и строительства искусственных факторов сплайсинга, которые могут специально манипулируют альтернативный сплайсинг гена-мишени. Этот метод использует преимущества уникальной РНК связывающим режиме ППУ повторяет для получен...

Большинство генов человека подвергаются альтернативного сплайсинга (AS) , чтобы произвести несколько изоформ с различными деятельности, что значительно увеличило сложность кодирования генома 1, 2. AS обеспечивает большую механизм для регулирования функции гена, и он жестко регулируется посредством различных путей в различной клеточной и развитии стадии 3, 4. Поскольку сращивание misregulation является частой причиной заболевания человека 5, 6, 7, 8, нацеливание регулирования сплайсинга становится привлекательным терапевтическим маршрутом. В соответствии с упрощенной модели регулирования сплайсинга, как в основном контролируется сращивания регуляторной цис - элементы (SRES) в пре-мРНК , которые функционируют в качестве усилителей сплайсинга или глушителей альтернативных экзонов. ThESE SRES специально набирать различный транс -Актерских белковые факторов (т.е. факторы сплайсинга) , которые способствуют или подавляют реакцию сплайсинга 3, 9. Большинство факторов сплайсинга транса -Актерских имеют отдельный РНК последовательности специфической связывающие домены для распознавания их целей и эффекторных доменов для управления сплайсингом. Наиболее известные примеры являются членами серина / аргинин-богатых (SR) семейства белков , которые содержат N-концевой РНК Признание Мотивы (РРС), которые связываются exonic энхансеров сплайсинга, и С-концевые RS доменов, которые способствуют экзону включения 10 , С другой стороны , hnRNP А1 связывается с exonic сплайсинга глушителей через RRM доменов и ингибирует включение экзона через C-концевой глицин-богатых доменов 11. Использование таких модульных конфигураций, исследователи должны иметь возможность проектировать искусственные факторы сплайсинга путем объединения специфической РНК-связывающий домен (RBD) с различными эфКоторые активируют или ингибируют сплайсинг. Ключом такой конструкции является использование RBD, который распознает заданные цели с программируемой специфичностью связывания РНК, что аналогично режиму связывания ДНК домена TALE. Однако большинство родных факторов сплайсинга содержат RRM или K гомологичные (KH) домены, которые распознают короткие элементы РНК со слабой аффинностью и, следовательно, не имеют прогностического «кода» распознавания РНК-белка. RBD повторных белков PUF ( т.е. PUF-домен) обладает уникальным режимом распознавания РНК, что позволяет редизайн доменов PUF специфически распознавать разные мишени РНК 13 , 14 . Канонический домен PUF содержит восемь повторов трех α-спиралей, каждый из которых распознает одно основание в мишени 8-nt РНК. Боковые цепи аминокислот в определенных положениях второй α-спирали образуют специфические водородные связи с краем Уотсона-Крика tон РНК базы, которая определяет РНК специфичность связывания каждого повтора (рис 1А). Код РНК базового признания ППУ повтора на удивление прост (Фигура 1А), что позволяет для генерации ППУ доменов , которые распознают любую возможную 8-базовую комбинацию (обзор Wang Wei и 15). Этот модульный принцип конструкции позволяет генерацию Engineered сращивания фактора (ФЭБ) , который состоит из настраиваемой ППЫ области и области сплайсинга модуляции (т.е. домена SR или Кли-богатого домен). Этот ESFS может функционировать либо как сплайс - активаторы или ингибиторы , как управлять различными типами сплайса событий, и они оказались полезными в качестве средств для манипулирования сплайсинга эндогенных генов , связанных с заболеванием человека 16, 17. В качестве примера, мы построили ESFS ППУ-Гли-типа специфически изменить сплайсинг гена Bcl-X, Превращая антиапоптозную длинную изоформы (Bcl-XL) в проапоптотическую короткую изоформы (Bcl-Xs). Сдвиг отношения Bcl-X изоформы было достаточно , чтобы привлечь внимание несколько раковых клеток в нескольких химиотерапевтических препаратов против рака 16, предполагая , что эти искусственные факторы могут быть полезны в качестве потенциальных терапевтических реагентов. В дополнение к управлению сращивание с известными сплайсинга эффекторных доменов (например, RS или Gly-богатых доменов), сконструированные ППУ факторы также могут быть использованы для изучения деятельности новых факторов сплайсинга. Например, при использовании этого подхода, мы показали , что С-концевой домен из нескольких SR белков может активировать или ингибировать сплайсинг при связывании с различными пре-мРНК областей 18, что аланин-богатый мотив RBM4 может ингибировать сплайсинг 19, и что пролин-богатый мотив DAZAP1 может усилить сплайсинг 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Эти новые функциональные домены могут использоваться для построения дополнительных типов искусственных факторов для точной настройки сплайсинга.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

Обработка большинства эукариотических РНК опосредуется РНК-связывающими белками (RBP) с модульными конфигурациями, включая модуль распознавания РНК, который специфически связывает мишень пре-мРНК и эффекторный домен. Раньше мы использовали уникальный способ связывания РНК PUF-домена в человеческом Pumilio 1 для генерации программируемого RNA binding scaffold, который использовался для разработки различных искусственных RBP для манипулирования метаболизмом РНК. Здесь описывается подробный протокол, чтобы построить Engineered Splicing Factors (ESF), специально предназначенные для модуляции альтернативного сплайсинга целевых генов. Протокол включает в себя то, как спроектировать и построить настраиваемый PUF-каркас для конкретной целевой РНК, как построить плазмиду экспрессии ESF, сплавляя дизайнерский PUF-домен и эффекторный домен, и как использовать ESF для манипулирования сплайсированием целевых генов. В репрезентативных результатах этого метода мы также описали общие анализыАктивности ESF с использованием сплайсинга репортеров, применения ESF в культивируемых клетках человека и последующего эффекта изменений сплайсинга. Следуя подробным протоколам в этом отчете, можно разрабатывать и генерировать ESF для регулирования различных типов альтернативного сплайсинга (AS), предоставляя новую стратегию изучения регуляции сплайсинга и функции различных сплайсинговых изоформ. Более того, путем слияния различных функциональных доменов с разработанным доменом PUF, исследователи могут создавать искусственные факторы, которые нацелены на конкретные РНК для манипулирования различными этапами обработки РНК.

Этот отчет описывает полный протокол для проектирования и строительства ESFS и сращивания репортеров. Он также описывает дальнейшее применение ESFS в манипулировании AS эндогенных генов 16. Чтобы проиллюстрировать типичные результаты ФЭБ-опосредованные изм?...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Этот отчет описывает способ биоинженерии на проектирование и строительство новых искусственных сплайсинг факторов (ASFs), которые специфически модулируют сплайсинг генов-мишеней в клетках млекопитающих. Этот метод может быть дополнительно расширен инженером различных искусственных факторов, манипулировать другие аспекты метаболизма РНКА.

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...