Name: engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-CA158283 och NSFC ger 31.400.726 till ZWYW finansieras av Young tusen talenter Program och National Natural Science Foundation of China (bidrag 31471235 och 81422038). XY finansieras av postdoktorala Science Foundation of China (2015M571612).

1. Konstruktion av en PUF Scaffold med skräddarsy RNA-bindande specificitet genom överlappande PCR <ol><li> Utforma en serie av PCR-primrar innehållande de PUF sekvenser som specifikt känner igen olika RNA nukleotider i varje position 12 (se tabell 1 för primersekvenserna och se figur 1 A för RNA: PUF igenkänningskoden). För varje PUF upprepa att utforma fyra olika primers känna igen en annan bas på varje position. ...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li><li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+day+in+the+life+of+the+spliceosome.">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li><li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics.">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li><li>Wang, G. -. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+disease:+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery.">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li><li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease.">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li><li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine/serine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing.">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li><li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer.">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li><li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA:+is+there+a+code+for+recognition.">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li><li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio/FBF+(PUF)+RNA-binding+domains.">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li><li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nyg&#229;rd, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins.">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li><li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities.">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li><li>Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities.">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li><li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities.">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis.">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li><li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intronic+splicing+enhancers,+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules.">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li><li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK/Erk-regulated+cell+proliferation+and+migration.">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements.">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li><li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control.">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer.">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li><li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold.">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li><li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis.">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732 (2009).</li><li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer.">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li><li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer.">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).</li><li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer:+pathways+and+programs+unhinged.">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li><li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer.">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Anczuk&#242;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer.">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li></ol>

Denna rapport ger en detaljerad beskrivning av konstruktionen och konstruktionen av artificiella splicingsfaktorer som specifikt kan manipulera den alternativa splitsningen av en målgen. Denna metod utnyttjar det unika RNA-bindnings-läget för PUF-repeter för att producera ett RNA-bindningsställ med anpassad specificitet. Det kan användas för att antingen aktivera eller undertrycka splitsning. Det kritiska steget i detta protokoll är genereringen av den omprogrammerade PUF-domänen so...

De flesta humana gener genomgår Alternativ Splicing (AS) för att producera flera isoformer med olika aktiviteter, vilket kraftigt har ökat den kodande komplexiteten hos genomet 1 , 2 . AS tillhandahåller en viktig mekanism för att reglera genfunktionen, och den regleras strikt genom olika vägar i olika cellulära och utvecklingssteg 3 , 4 . Eftersom splitsning av felreglering är en vanlig orsak till mänsklig sjukdom 5 , 6 , 7 , 8 , blir målriktning av splitsningsreglering en attraktiv terapeutisk väg. Enligt en förenklad modell för splitsningsreglering kontrolleras AS huvudsakligen av Splicing Regulatory cis- Elements (SREs) i pre-mRNA som fungerar som splicing enhancers eller silencers of alternative exons. ThEse SREs rekryterar specifikt olika transaktiva proteinfaktorer ( dvs splitsningsfaktorer) som främjar eller undertrycker splitsningsreaktionen 3 , 9 . De flesta transaktiva splitsningsfaktorerna har separata sekvensspecifika RNA-bindande domäner för att igenkänna deras mål och effektordomäner för att styra splitsning. De mest kända exemplen är medlemmarna i den serin / argininrika (SR) -proteinfamiljen som innehåller N-terminala RNA-erkännandemotiv (RRM), vilka binder exoniska splitsningsförstärkare och C-terminala RS-domäner, vilket främjar exon inkludering 10 . Omvänt binder hnRNP A1 till exoniska splitsningsdämpare genom RRM-domänerna och hämmar exonintegration genom en C-terminal glycinrik domän 11 . Med hjälp av sådana modulära konfigurationer bör forskare kunna konstruera artificiella splitsningsfaktorer genom att kombinera en specifik RNA-bindande domän (RBD) med olika effekttor domäner som aktiverar eller hämmar splitsning. Nyckeln till en sådan utformning är att använda en RBD som identifierar given mål med programmerbar RNA bindningsspecificitet, som är analog med den DNA-bindande läget av berättelsen domänen. Dock de flesta nativa splitsningsfaktorer innehåller RRM eller K Homologi (KH) domäner, som känner igen korta RNA element med svag affinitet och således saknar en prediktiv RNA-proteinigenkänning &quot;kod&quot; 12. RBD av PUF upprepningsproteiner (dvs. PUF-domänen) har en unik RNA-igenkänningsmoden, vilket möjliggör den nya utformningen av PUF domäner att specifikt känna igen olika RNA-mål 13, 14. Den kanoniska PUF domänen innehåller åtta upprepningar av tre a-helixar, vardera som igenkänner en enda bas i en 8-nt RNA-målet. Sidokedjorna av aminosyror vid vissa positioner för de andra α-helix bildar specifika vätebindningar med Watson-Crick-kanten av than RNA bas, som bestämmer det RNA-bindande specificiteten för varje upprepning (Figur 1A). Koden för RNA bas erkännande av PUF upprepningen är förvånansvärt enkel (figur 1 A), vilket möjliggör generering av PUF domäner som känner igen eventuella 8-baskombination (översikt av Wei och Wang 15). Denna princip modulär design tillåter generering av en Engineered Skarvning Factor (ESF) som består av en anpassad PUF domän och en skarvningsmodule-domän (t.ex. en SR-domän eller en Gly-rika domän). Dessa ESFS kan fungera som antingen splits aktivatorer eller som inhibitorer för att styra olika typer av splitsningshändelser, och de har visat sig vara användbara som verktyg för att manipulera splitsning av endogena gener relaterade till human sjukdom 16, 17. Som ett exempel, har vi konstruerat PUF-Gly-typ ESFS att specifikt förändra splitsning av Bcl-genen, Omvandling av den anti-apoptotiska lång isoform (BcI-Xl) till pro-apoptotiska korta isoformen (Bcl-xS). Skiftning förhållandet mellan Bcl-x-isoform var tillräcklig för att sensibilisera flera cancerceller till flera anticancerkemoterapiläkemedel 16, vilket tyder på att dessa artificiella faktorer kan vara användbara som potentiella terapeutiska reagens. Förutom att styra splitsning med kända skarvnings effektordomäner (t ex en RS eller Gly-rika domän), kan de konstruerade PUF faktorer också användas för att undersöka verksamheten i nya splitsfaktorer. Exempelvis med användning av detta tillvägagångssätt har vi visat att den C-terminala domänen av flera SR proteiner kan aktivera eller inhibera splitsning då bindning till olika pre-mRNA-områdena 18, att den alanin-rika motivet av RBM4 kan hämma splitsning 19, och att den prolinrika motiv i DAZAP1 kan förbättra skarvning 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Dessa nya funktionella domäner kan användas för att konstruera ytterligare typer av konstgjorda faktorer för att finjustera skarvning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer</td>
			<td style="width:155px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:103px;">M0530L</td>
			<td style="width:491px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA ligase (T4 DNA ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)</td>
			<td>ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARP&#160;antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bcl-x antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Amersham-Pharmacia</td>
			<td>RPN203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting detection reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>WP20005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5-dCTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA55021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>FACSCalibur&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4832</td>
			<td>Filter sterilize and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector&#160; pWPXLd</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vector psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Oligo(dT)18 Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO131&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering artificial factors to specifically manipulate alternative splicing in human cells

Bearbetning av de flesta eukaryota RNA medieras av RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) med modulära konfigurationer, inkluderande en modul RNA erkännande, som specifikt binder den pre-mRNA-mål och en effektordomän. Tidigare har vi dragit fördel av den unika RNA-bindningsläge för PUF-domänen i humant pumilio 1 för att generera en programmerbar RNA-bindande scaffold, som användes för att konstruera olika artificiella RBP-anordningama för att manipulera RNA-metabolism. Här, är ett detaljerat protokoll beskrivs att konstruera Engineered Skarv Faktorer (ESFS) som är särskilt utformade för att modulera alternativ splitsning av målgener. Protokollet innefattar hur man kan utforma och konstruera en anpassad PUF byggnadsställning för ett specifikt mål-RNA, hur man konstruerar en ESF expressionsplasmid genom att fusera en designer PUF domän och en effektordomän, och hur man använder ESFS att manipulera splitsning av målgener. I representativa resultat av denna metod har vi också beskrivit de gemensamma analysernaav ESF-aktiviteter med hjälp av splits reportrar, tillämpningen av ESF i odlade humana celler, och den efterföljande effekten av splits förändringar. Genom att följa de detaljerade protokoll i denna rapport är det möjligt att utforma och skapa ESFS för reglering av olika typer av alternativ splitsning (AS), vilket ger en ny strategi för att studera skarvning reglering och funktion olika skarv isoformer. Dessutom, genom att fusera olika funktionella domäner med en designad PUF domän kan forskare ingenjör artificiella faktorer som riktar specifika RNA för att manipulera olika steg i RNA-bearbetning.

Denna rapport beskriver hela protokollet för design och konstruktion av ESFS och skarvning reportrar. Den beskriver också den ytterligare tillämpning av ESFS i manipulera AS av endogena gener 16. För att illustrera typiska resultat av ESF-medierad skarvning förändringar använder vi data från vårt tidigare arbete som ett exempel. ESFS med olika funktionella domäner kan användas för att främja eller hämma införandet av målet kassett exon <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells at JoVE.com

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Denna rapport beskriver en bioteknik metod för att utforma och konstruera nya Artificiella Skarv Faktorer (ASFs) som specifikt modulerar splitsning av målgener i däggdjursceller. Denna metod kan utvidgas ytterligare för att konstruera olika artificiella faktorer att manipulera andra aspekter av RNA-metabolism.

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfektion och EMSA Analyser av nyligen isolerade mänskliga villös cytotrofoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cell baserat analyser av SINEUP icke-kodande RNAs som specifikt kan förbättra mRNA Översättning

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral medierad gen ljuddämpning i humant Pseudoholmen beredd i låga fästplattor

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...