Name: co-localization of cell lineage markers and the tomato signal
Uploaded: 2016-12-28T14:00:00
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This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

Todos os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Texas A &amp; M University College of Dentistry. Reprodução 1. animal <ol><li> Use três modelos animais neste estudo. Para investigar o destino dos condrócitos embrionárias na formação côndilo, primeiro uso Col10a1-Cre 15 ratos e passe com Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J)...

<ol>
	<li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification.">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte:+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate.">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage.">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li><li>Roach, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Chondrocyte:+No+Bones+about+It.">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li><li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter.">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts:+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters.">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors.">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li><li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage.">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li><li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes.">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li><li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse?.">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li><li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes:+death+or+lineage+extension?.">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?.</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li><li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice.">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse.">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li><li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes.">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li><li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing.">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li><li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+induces+rapid,+reversible+atrophy,+and+metaplasia+in+mouse+stomach.">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li><li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen.">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER(T)+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li></ol>

Devido às limitações tecnológicas, é sempre difícil de investigar o comportamento de células in vivo. No entanto, a técnica de linhagem celular de rastreamento está provando ser uma ferramenta poderosa para estudar biologia celular 7-9. Neste estudo, nós melhorar ainda mais este protocolo, combinando-a com a imunofluorescência. Deste modo, o destino da célula pode ser definido por vários marcadores relacionados, que alarga a aplicação do rastreio linhagem. Além disso, esta co-localiza...

Durante o desenvolvimento, a formação de osso endocondral responde por mais de 80% do volume do esqueleto. Acredita-se que começa com a apoptose de condrócitos hipertróf icos. Subsequentemente, as células da medula óssea subjacente invadir e iniciar angiogénese, seguido por nova deposição óssea por marrow- óssea e células derivadas de periósteo 1,2. O destino de células de condrócitos hipertróficas (HCs), no entanto, tem sido um tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, foram consideradas HCs ser o final da via de diferenciação de condrócitos, e a apoptose foi geralmente considerado para ser o destino final de HCs. Agora, alguns investigadores sugerem que pelo menos alguns HCs poderia sobreviver e contribuir para a formação de osso endocondral. Embora eles proposto que o crescimento dos condrócitos placa tinha a capacidade de transdiferenciar em osteoblastos com base em ultra-estrutura, coloração imuno-histoquímica, e estudos in vitro, 46, nenhum destes métodos were definitiva em condrócitos demonstrando contribuição para a linhagem dos osteoblastos. A técnica de linhagem celular de rastreamento fornece uma maneira mais rigorosa para estudar o destino celular. Resumidamente falando, uma enzima recombinase, o qual é expresso apenas em um tipo específico de célula, estimula a expressão do gene repórter. Desta forma, este tipo de célula e seus descendentes são permanentemente marcado 7. O sistema Cre-loxP é comumente usado no rastreamento de linhagem. Cre (a enzima recombinase) vai excisar a sequência de paragem entre os dois locais loxP e activar o repórter em uma linha celular específica (Figura 1A). Em alguns casos, o investigador pode escolher um ponto de tempo favorável para activar Cre usando uma droga, tal como tamoxifeno, causando Cre para fundir a uma forma modificada do receptor de estrogénio (Cre ERT2) 8. repórteres fluorescentes tornaram-se o padrão na linhagem rastreamento experimentos porque reduzem drasticamente a complexidadee melhorar a precisão e eficiência da célula destino traçado 8,9. tdTomato está se tornando a melhor escolha entre os repórteres fluorescentes uma vez que tem o mais brilhante proteína fluorescente ea epifluorescência mais forte, tornando-se facilmente visualizado 7 (Figura 1A). Ao utilizar o Rosa26 tdTomato linhagem sistema de detecção, o nosso grupo e outros investigadores mostraram que HCs pode alterar o seu fenótipo em células ósseas durante o desenvolvimento 10-14. Para conseguir isso, nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações com Rosa26 tdtomato (expressão omnipresente em todas as células) / Cre (específico para condrócitos) ratos: 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram que ambos os métodos são meios viáveis para estudar o destino celular in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tamoxifen&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T5648</td>
			<td style="width:496px;">activate the Cre event&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fix the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10713</td>
			<td>decalcify the hard tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td>dehydrate the tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>retrieve antigen for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A3059</td>
			<td>blocking solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for Runx2&#160;</td>
			<td>Cell Signal</td>
			<td>D1L7F</td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for DMP1</td>
			<td style="width:220px;">provided by Dr. Chunlin Qin</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18140</td>
			<td>control for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>second antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>embed the sample for frozen section</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>PBST</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-fluorescing antifade mountant</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td>mounting slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td>nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>circle the section on the slide for for immunochemical staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:220px;">AnaSed</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaset&#160;</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">cryosection machine</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td>DM6000 CFS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-localization of cell lineage markers and the tomato signal

O sistema de rastreamento de linhagem celular foi usado predominantemente em estudos de biologia do desenvolvimento. A utilização da recombinase Cre permite a activação do repórter em uma linha celular específica e toda a progénie. Aqui, utilizou-se a linhagem de células rastreio técnica para demonstrar que os condrócitos transformar directamente em osteoblastos e os osteócitos durante ossos longos e desenvolvimento côndilo mandibular utilizando dois tipos de Cre, Col10a1-Cre e agrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzados com Rosa26 tdTomato. Ambos Col10 e agrecano marcadores são bem reconhecido para condrócitos. Nesta base, nós desenvolvemos uma nova linhagem de células método de rastreio em conjunto com o destino celular imuno-fluorescente para definir por meio da análise da expressão de marcadores de células específicos. Runx2 (um marcador de células osteogênicas em início de carreira) e protein1 matriz de dentina (DMP1; um marcador para células em estágio final osteogênicos) foramutilizado para identificar as células de osso derivadas de condrócitos e o seu estado de diferenciação. Esta combinação não só amplia a aplicação de rastreio linhagem celular, mas também simplifica a geração de ratinhos compostos. Mais importante, os status de número, a localização e diferenciação de progênie de células-mãe são exibidos simultaneamente, fornecendo mais informações do que a linhagem celular de rastreamento sozinho. Em conclusão, a co-aplicação de técnicas de rastreio de linhagem celular e de imunofluorescência é uma ferramenta poderosa para investigar a biologia de células in vivo.

Condrócitos Diretamente transformar em células ósseas (osteoblastos e osteócitos) no Mandibular Condyle e Long Bone. Agrecano, um gene crítico para chondrogenesis, se expressa principalmente no início e maduros condrócitos 18. Como resultado, a injecção de tamoxifeno às 2 semanas de idade em Agg-Cre ERT2; Camundongos Rosa26 tdTomato activado...

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Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações em Rosa26 tdtomato (ubiquamente expressa em todas as células) / Cre (especificamente expresso em condrócitos) camundongos: um com 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e um com imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram a transformação directa de condrócitos em células ósseas.

Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

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