Name: high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells at JoVE.com

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant n&#186; 32003B_127619).

1. Cellodling <ol><li> Kultur humana hepatom HepG2-celler 6 i 25 cm 2 cellodlingsflaskor i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (såddtäthet: 1 x 10 6 celler per 25 cm 2 cellodlingskolv, inkubationstid i 37 ° C inkubator: 48 h, celldensitet vid sammanflytning: 4-5 x 10 6 celler per 25 cm 2<...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li><li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen.">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+remifentanil+on+mitochondrial+oxygen+consumption+of+cultured+human+hepatocytes.">Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes.</a> PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes.">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li><li>Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+conformations+of+physiological+membrane-bound+cytochrome+c.">Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c.</a> Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).</li><li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer.">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control.+An+Introduction+to+OXPHOS+Analysis.">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis.</a> Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).</li></ol>

Syftet med detta protokoll var att använda hög upplösning respiration att mäta mitokondriella andningskedjan komplex &quot;(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet. Det finns några viktiga steg i detta protokoll. Först är cellulära syreförbrukningshastigheter vanligtvis normaliserad till antalet celler (pmol / [sek x antal celler]). Därför innan övervaka cellulär syreförbrukning, är det vikti...

Mitokondrier fyller viktiga roller i cellulär energimetabolism, i synnerhet genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP). De är inblandade i celldöd och i flera humana sjukdomar. Mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) kombinerar elektrontransport längs elektrontransportkedjan med syreförbrukning och ATP-syntes. Den mitokondriella trikarboxylsyra (TCA) cykel är inblandad i omvandlingen av proteiner, kolhydrater och fetter i energirika föreningar som nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och flavinadenindinukleotid (FADH2). Elektroner av NADH och FADH2 överförs sedan till andningselektrontransportkedjan proteinkomplex (I-IV) som är belägen i det inre mitokondriemembranet. Dessutom kan två andra redox vägar överföra elektroner till elektrontransportkedja: i) mitokondriell elektronöverförande flavoprotein (ETF), som är belägen på matrisen ytan av det inre mitochondrial membran, och levererar elektroner från fettsyra β-oxidation; och ii) mitochondrial glycerofosfatdehydrogenas som oxiderar glycerofosfat till dihydroxiaceton fosfat och matar elektroner till den mitokondriella elektrontransportkedjan. Komplex IV (den ultimata elektronacceptor) överför elektronerna till en syremolekyl, omvandla syre till två vattenmolekyler. Förflyttning av elektronerna från andningselektrontransportkedjan komplex I-IV är kopplad med protonflöde från den mitokondriella matrisen till intermembrane utrymme som etablerar en elektrokemisk gradient över det mitokondriella innermembranet. Efteråt mitokondriella komplex V (ATP-syntas) skyttlar vätejonerna tillbaka in i mitokondriematrisen och syntetiserar ATP-molekyler. OXPHOS funktion kan bedömas in vivo och in vitro med användning av olika tekniker och olika mitokondriella respirationstillstånd kan erhållas. I isolerade mitokondrier följande respiratory tillstånd kan mätas: i) basal mitokondrie andning (tillstånd 1), ii) syreförbrukningen efter tillsats av specifika substrat av mitokondriella andningskedjan komplex (tillstånd 2), iii) maximal mitokondrie syreförbrukning efter tillsats av mättande koncentrationer av adenosindifosfat (ADP) (tillstånd 3) och iv) vilande andning efter ADP konsumtion (omräknat till ATP) (tillstånd 4). I intakta celler följande andningstillstånd kan mätas: i) basalcellsyreförbrukning i närvaro av endogena substrat och ADP, ii) basalcellsyreförbrukning i närvaro av oligomycinkänslig (oligomycinkänslig-okänsliga andning) och oligomycinkänslig känsliga andning (ATP omsättningen), iii) FCCP okopplade andning, och iv) icke-mitokondrie andning efter tillsats av antimycin A och rotenon. I permeabiliserade celler, kan specifika substrat av elektrontransportkedjan komplex och ADP tillsättas och maximala komplexa beroende respirationshastigheter arådana så komplext I-, II- och IV-beroende respirationshastigheter kan mätas. Mätningar av cellandningen ge viktiga insikter i mitokondriell lungkapacitet är specifik för komplex I-IV, mitokondriell integritet och energiomsättning en, två, tre. En av anordningarna som möjliggör mätningar av mitokondriell syreförbrukning med hög noggrannhet, upplösning och känslighet är den högupplösta oxygraph 4. Den högupplösta oxygraph enheten innehåller två kammare med insprutningsöppningar och varje kammare är utrustad med en polarografisk syresensor. Cellulära eller isolerade mitokondriella suspensioner rörs kontinuerligt i respirometer. För att bedöma mitokondriefunktion, substrat och inhibitorer för mitokondriell komplex aktivitet kan tillsättas efter standardprotokoll. Substrat och inhibitorer kan titreras genom injektion into kamrarna i oxygraph och syreförbrukning beräknas med hjälp av programvara och uttrycktes som pikomol per sekund per antalet celler. Högupplöst respiration erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella och konventionella polarografisk syreelektrod enheter inklusive ökad känslighet och förmåga att arbeta med ett litet antal biologiska prover, såsom intakta eller permeabiliserade celler. Dessutom innehåller varje enhet två kamrarna, och respirationshastigheter kan spelas in samtidigt vid jämförelse av syrekoncentrationer. Den högupplösta oxygraph har också fördelen av minskat läckage av syre från enhetens kamrarna jämfört med traditionella polarografiska syreelektrodanordningarna. En annan anordning som nyligen utvecklats för att mäta cellulär syreförbrukningen är 96 brunnar extracellulärt flöde analysator 5. Den extracellulära flödes analysator är utrustad med fluorescens istället för polarografiska sensorer. Fördelarna med den extracelluläraflux analysator jämfört med den högupplösta oxygraph är i) det är en stor del automatiserad enhet, ii) det är möjligt att mäta syreförbrukningen i 24- och 96-brunnsplattor för high-throughput screening, därför kräver mindre mängder av biologiska prover, och iii) ytterligare en mätning av cellulär glykolytiska flux är möjlig. Nackdelarna med den extracellulära flödes analysatorn i jämförelse med den högupplösta oxygraph är i) de höga kostnaderna för enheten och av förbrukningsmaterial såsom fluorescerande plattor, som är icke-återanvändbara, och ii) endast fyra föreningar per analys / brunn är injicerbara systemet är därför inte möjligt för substrat-frikopplare-inhibitor titrering protokoll. I den aktuella studien använder vi hög upplösning respiration att bestämma mitokondrie andning. För cellulära syreförbrukning experiment cellerna permeabiliseras för att tillåta inträde av exogent ADP och oxider mitokondriella substrat för matning elektroner in i complexes i andningsorganen. Detta tillvägagångssätt gör dissektion av enskilda mitokondriella komplex andningskapacitet, vilket är en klar fördel jämfört med intakta celler (många substrat cell ogenomträngligt). Emellertid kommer cellmembranet permeabilization störa barriären mellan cytosolen och extracellulära utrymmet och medium (tvätta ur cytosoliska lösta ämnen) och sammansättningen av det intracellulära utrymmet jämviktas med det extracellulära mediet. En av nackdelarna med permeabiliserade celler över intakta celler är att det mitokondriella yttre membran kan skadas om stora mängder rengöringsmedel används under cell permeabilization. I intakta celler, basala, kopplade och okopplade andning av intakta celler kan mätas. Denna metod utvärderar syreförbrukningen hos intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen och även tillhandahålla information om maximal mitokondriella elektron transport kapacitet 6, 7. En av fördelarna med intakta celler över permeabiliserade celler är att cellulära miljön inte störs och mitokondrier är i kontakt med hela komponenter av cellerna. För att permeabilisering cellplasmamembranet, har rengöringsmedel såsom digitonin använts åtta. Däremot kan mitokondrie yttre membran integritet äventyras om stora mängder digitonin användes. För att bekräfta att mitokondriell yttre membran integritet inte äventyras i permeabiliserade celler, digitonin titrering för att bestämma den optimala koncentrationen för cellulär permeabilization. För dessa experiment, celler återsuspenderades i andningsmedium och digitonin koncentrationen titreras genom respiration i närvaro av mitokondriella substrat och ADP, och andningsfrekvens mäts. Respiration av intakta, icke-permeabiliserade celler stimuleras inte i närvaro av mitochondrial substrat och ADP. Men skulle efterföljande stegvis digitonin titrering ge gradvis permeabilization av plasmamembran, och optimal digitonin koncentration erhålls. Detta visas genom ökningen av andning upp till full permeabilization. Kan verifieras mitokondrie kvalitet och yttre membran integritet genom att tillsätta exogena cytokrom c 2, 9. Cytokrom c är ett 12 kDa elektronbärande proteinet av den mitokondriella elektrontransportkedjan 10, 11, 12. Den är lokaliserad i den mitokondriella intermembrane utrymme, och är involverad i syreförbrukning, bärande elektroner från komplex III till komplex IV. När mitokondriella yttre membranet är skadat, är cytokrom c frigörs och mitokondriesyreförbrukningen minskar. Vid tillsats av exogen cytokrom c, är ett tecken på en något augmentation i mitokondriell andningstörde mitokondriell yttre membranet. I permeabiliserade celler, substrat och hämmare av mitokondrie komplex aktivitet tillsätts efter olika protokoll 3, 9. Exempelvis i syfte att undersöka mitokondriella komplexa driven respirationshastigheter kan användas följande protokoll. Efter permeabilisering av cellerna, är första komplex I stimuleras av substraten malat och glutamat, som alstrar NADH som ett substrat för andningskedjan och provocera aktiveringen av komplex I. Efteråt ADP tillsättes för omvandling till ATP (tillstånd 3, aktiv komplex I-beroende andning). Efter en stabil signal uppnås, är rotenon (mitokondriell komplex jag hämmare) som administreras för att hämma komplexa I. Rotenon följs av succinat till FADH2 och aktivera komplex II (tillstånd 3, aktivt komplex II-beroende andning). För att mäta komplexa IV beroende andning, första komplex III-beroende andning hämmas genom tillsats av antimycin A (mitokondriell komplex III-hämmare). Efteråt är komplex IV beroende andning stimuleras genom administrering askorbat och tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oxidera i respiration buffert, därför den maximala komplexa IV beroende respirationshastigheten (State 3) beräknas genom att subtrahera andningsfrekvens före och efter tillsatsen av natrium-azid, en inhibitor av mitokondriell komplex IV. De andnings experiment kan utföras i två kamrar en oxygraph i parallell en portion som en kontroll (ostimulerade celler), det andra innehåller de stimulerade cellerna. Uppenbarligen, kan cellerna förbehandlas på olika sätt, t.ex., med läkemedel som påverkar mitokondriella funktioner, innan deras syreförbrukning mäts i oxygraph kammaren. Detta protokoll möjliggör funktionell undersökning av de enskilda mitokondriella andningskedjan komplex. Dessutom kan man mäta maximal ADP-stimuleraderespiration (tillstånd 3) av permeabiliserade celler, med användning av exogen fettsyra i form av palmitat. I detta protokoll är koncentrerade bestånd av natriumpalmitat konjugerat med ultrafettsyrafritt bovinserumalbumin (BSA) (6: 1 molförhållande palmitat: BSA). Efteråt celler först är permeabiliserade med digitonin och mitokondrie andning bedöms genom tillsats av karnitin och palmitat följt av tillsats av ADP (tillstånd 3, maximal andning). Därefter oligomycin sätts för att efterlikna tillståndet 4 (stat 4o) och andningskontroll kvoten (RCR värde) beräknas som tillstånd 3 / tillstånd 4o. β-oxidation gynnar produktionen av acetyl-CoA (som kommer in i TCA-cykeln) och generering av FADH2 och NADH, elektronerna av vilka överförs till elektrontransportkedjan genom elektronöverförande flavoprotein och β-hydroxiacyl-CoA-dehydrogenas. Mitokondrierna är i centrum för fettsyrametabolism och beskrivs palmitat-BSA protokoll kan användas av forskare undersöker fettty acid oxidation. I intakta celler, aktivatorer och inhibitorer av mitokondriekomplex aktivitet tillsätts efter ett annat protokoll 6, 9. För dessa experiment är första syreförbrukning av icke-permeabiliserade celler i frånvaro av exogena substrat mäts (fosforylerande andningsfrekvens). Därefter är den icke-fosforylerande respirationshastigheten mäts efter tillsatsen av oligomycin, som är en inhibitor av mitokondriell ATP-syntas. Efteråt protonophore karbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administreras vid olika koncentrationer och maximal mitokondriella okopplade andningsfrekvens mäts. Protonophores såsom FCCP kan inducera en ökning i proton permeabilitet det inre membranet, vilket möjliggör passiv rörelse av protoner för att skingra chemiosmotic lutning. En ökning av proton permeabilitet syftar till att skilja oxidativ respiration (ingen ATP-produktionen) och inducerar en ökning av oxygen konsumtion. Efteråt är rotenon och antimycin A tillsättes för att hämma mitokondrie respiration, och icke-mitokondriell andning subtraheras från alla andra andningsfrekvenser. De syreförbrukning kan uttryckas som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (syreflöde per miljon celler) som beräknas genom att dividera volymspecifik syreflödet (i den slutna syrekammaren), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] av cellkoncentrationen i cellkammaren (antalet celler per volym [10 6 celler ∙ ml 1]) 15. Cell-massa specifik syreflödet, JO 2 [pmol x sek -1 x mg -1], är flödet per cell, IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] dividerat med massa per cell [mg ∙ 10 6-celler]; eller volymspecifik flux, JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] dividerat med massa per volymUME [mg ∙ ml 1]. JO 2 är syreflödet per cellprotein, torrvikt eller cellvolym. I föreliggande studie med användning av högupplösande respiration, beskriver vi protokoll för att bestämma i) optimalt digitonin koncentration för fullständig cellulär plasmamembran permeabilisering (digitonin titrering analys), ii) mitokondriell yttermembranintegritet med användning av exogena cytokrom c, iii) mitokondriella andningskedjan komplex I , II och IV maximala andningsfrekvens i digitonin-permeabiliserade HepG2-celler i närvaro av exogen ADP och mitokondriella andningskedjan substrat, och iv) basal, kopplade och maximal okopplad andning (maximal elektron transportkapacitet) av intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">ADP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 4386</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 8674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:156px;">Ascorbate</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.00127</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">BSA</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 6003</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FCCP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 2920</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:75px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;">Automated cell counting instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Cytochrome c</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 7752</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Digitonin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">D 5628</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">31966021</td>
			<td style="width:92px;">Medium</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">EGTA</td>
			<td style="width:92px;">fluka</td>
			<td style="width:75px;">3779</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FBS</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">26010-074</td>
			<td style="width:92px;">Medium component</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Glutamate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma,</td>
			<td style="width:75px;">G 1626</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Hepes</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">H 7523</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KCl</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04936</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04873</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">K-lactobionate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">L 2398</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">MgCl2</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">M 9272</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:75px;">10000-02</td>
			<td style="width:92px;">High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">O 4876</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">15140122</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S2002</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Rotenone</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">R 8875</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Succinate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S 2378</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Taurine</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 8691</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">TMPD</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 3134</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td>T 4674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Bestämningen av optimala Digitonin Koncentration för Cellular Permeabilization: Digitonin Titrering Experiment Digitonin titrering utförs för att bestämma den optimala koncentrationen för permeabilisering av HepG2-celler. För dessa experiment är digitonin titreras i intakta celler i närvaro av rotenon, succinat (mitokondriell komplex II substrat) och en mättande mängd av ADP (för att inducera komplex II-beroende tills...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells at JoVE.com

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Hög upplösning respiration används för att bestämma mitokondriella syreförbrukning. Detta är en enkel teknik för att bestämma mitokondriella andningskedjan komplex &quot;(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet.

Högupplöst respiration att bedöma mitokondrie funktion i Permeabilized och intakta celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Cellular Processes

Cellular Respiration

SCIENTISTS IN ACTION

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

En snabbare, högupplöst, MTPA-GFP-baserade Mitokondriell Fusion analys förvärva Kinetiska Uppgifter om flera celler parallellt med användning av konfokalmikroskopi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Använda högupplöst datortomografi för att visualisera den tredimensionella strukturen och funktion växt kärlsystem

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Force Measurement under kontraktion att bedöma muskelfunktion i zebrafisk larver

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal avbildning av Single Mitochondrial Superoxid Blinkar i intakt hjärta eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studera Mitokondriell struktur och funktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Äggstockar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier från skelettmuskulatur genom differentialcentrifugering för Högupplösta respirometri Mätningar

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...