Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من المركز الطبي بجامعة ميسيسيبي. 1. علاج الحيوانات والأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة وال...

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز غير واضحة عموما، والتمسك بعض المفاهيم والتقنيات الأساسية يمكن أن يحسن من دقة القياسات توزيع الحيوي. موجات قصيرة من الخبرة الخفيفة على درجة عالية من التشتت والامتصاص في معظم الأنسجة، والتي كثيرا يؤثر على فائدة fluorophores الط...

وضع العلامات الفلورية هو طريقة استخدامها وفعالة بسهولة لتحديد التوزيع الحيوي للمركبات، وذلك باستخدام مجموعة من المعدات التي هي مشتركة بين العديد من المختبرات. وFluorophores على نطاق واسع، وغير مكلفة نسبيا، ويأتي في مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية، بحيث متعددة وصفت الجزيئات يمكن استخدامها في وقت واحد دون أي تدخل. معظم fluorophores لديها مجموعة من كيمياء لتصريف الافعال لمختلف المجموعات رد الفعل على المركبات المستهدفة، وعملية اقتران واضح ومباشر عموما لمعظم أنواع المواقع التفاعلية. بالإضافة إلى ذلك، المعدات اللازمة لقياس المركبات fluorescently المسمى شائعة في العديد من المعامل. المجهر الفلورسنت، والتصوير، والماسحات الضوئية الشرائح يمكن لجميع استخدامها في ظروف مختلفة، مما يجعل استخدام العلامات الفلورية الوصول للغاية. وكثيرا ما تستخدم تسميات الفلورسنت لتحديد توزيع الحيوية وحركية من المركبات على حد سواء في الجسم الحي وخارج فيفس مع أجهزة التصوير الحية، مثل الطيف IVIS تصوير، والأنسجة الأنسجة الكمية 2،3. وقد زاد استخدام خارج الجسم الحي التصوير كامل الجهاز باستخدام أجهزة الحية التصوير مع مرور الوقت نظرا لسهولة استخدامها والقدرة على خلق بسرعة إجراء مقارنة دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات وصفت دون الحاجة إلى مزيد من المعالجة tissues4. ومع ذلك، في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز يمكن أن تسمح لتحليل سهلة والمقارنة، فإنه لا تولد مقياس كمي للتركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. ويرجع ذلك إلى آثار تشتت الخفيفة داخل أجهزة سليمة هذا. منذ تشتت الضوء (وإلى حد أقل، الامتصاصية) يختلف حسب حجم الأنسجة وكثافة، ويمكن تصوير كامل الجهاز يقلل مستويات الأنسجة في أجهزة كبيرة أو الكثيفة. وضع معايير مناسبة لقياس تركيز المطلقة هي أيضا صعبة لأن واحدا يجب أن تحاكي سمكوكثافة كل جهاز على حدة. من ناحية أخرى، والتصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة للحصول على مستويات الأنسجة النسبية للعامل، وأنها مثالية للمقارنة بين النسبي الحيوي توزيع ذات الصلة متعددة الجزيئات (كما هو الحال في الدراسات التي تستهدف المخدرات). استراتيجية بديلة هو استخدام الأنسجة مضان الكمية، وهي تقنية مشتقة من طريقة تصوير الإشعاع الذاتي الكمي، للحصول على مستويات الأنسجة المطلقة من وكيل اختبار 5،6. بدلا من وضع كامل الحيوان أو جهاز إلى جهاز تخيل، تتطلب الأنسجة الأنسجة الكمية التي يتم شرائح كل الأنسجة، التي شنت على الشرائح، وفحصها، وتحليلها بشكل فردي. يتم إعداد معايير وكيل اختبار وشرائح في سمك نفس العينات الجهاز. من خلال قطع جميع الأجهزة ومعايير لنفس السمك، والقضاء على التباين يرجع ذلك إلى تشتت الضوء أو الامتصاصية، وكثافة مضان الأنسجة يمكن أن يكون لائقا لمنحنى القياسية لتحديد تناسق المطلقحصة. في حين أن هذا الأسلوب عندما يوظف بشكل صحيح، هو الكمي، كما أنها كثيفة العمالة وأسيء التعامل معها بسهولة. ونظرا لطبيعة أكثر تعقيدا من الأنسجة الكمية والتكلفة أعلى بكثير من العمل بالمقارنة مع التصوير كامل الجهاز، فإنه يصبح من المفيد دراسة حيث كل عملية هي الأكثر عملية لاستخدامها عند النظر في توزيع الحيوي لمركبات fluorescently المسمى. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية هذه الأساليب يمكن أن تستخدم جنبا إلى جنب لمقارنة كفاءة توزيع الحيوي من المسمى رودامين الإيلاستين مثل ببتيد (ELP)، مع أو بدون إضافة SynB1 أو تات الببتيدات اختراق الخلية، عن طريق الأنف (IN) وعن طريق الوريد (IV) طرق الإدارة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

وضع العلامات الفلورية هو عملية راسخة لدراسة مصير الجزيئات المسمى في إطار مجموعة من الظروف التجريبية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. تحقيقات الفلورسنت مفيدة بشكل خاص في تحديد التوزيع الحيوي من الجزيئات الكبيرة التي يديرها، حيث إضافة تسمية فلوري جزيء صغير من غير المحتمل أن تؤثر على حركية أو توزيع الحيوي للمجمع. مجموعة متنوعة من أساليب وجود لدراسة توزيع الحيوية التي تختلف بشكل كبير في مقدار الجهد المطلوب وعما إذا كانت القياسات الناتجة بشكل كامل الكمية، ولكن باستخدام أساليب متعددة بالتزامن يمكن توفير نظام سريع وفعال لتحليل-توزيعات الحيوي. فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو الطريقة التي يمكن استخدامها لمقارنة بسرعة تركيزات النسبية للجزيئات الفلورسنت داخل أنسجة وبين أنواع متعددة من الأنسجة أو مجموعات العلاج. باستخدام بلات التصويرالنموذج المعد لالحيوانات الحية أو التصوير كامل الجهاز، مضان داخل أنسجة سليمة يمكن تحديد دون مزيد من المعالجة، وتوفير الوقت والعمل في الوقت الذي توفر صورة دقيقة عن مجمل توزيع الحيوي. هذه العملية هي مثالية في التجارب محاولة تحديد خصوصية نسيج مركب أو المقارنة بين مركبات مختلفة متعددة. الأنسجة الأنسجة الكمية من ناحية أخرى تتطلب مزيد من المعالجة واسعة من الأنسجة من أجل إنشاء مقياس كمي للمركبات المسمى. إجراء تقييم دقيق الحيوي التوزيع، جميع أنسجة الفائدة يجب أن تكون شرائح، مسح، وتحليل نسبة إلى منحنيات القياسية من أجل إجراء مقارنات بين الأنسجة أو مجموعات. الأنسجة الأنسجة الكمية هي المعيار الذهبي لتحديد تركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. هنا، نحن تصف كيف كلتا الطريقتين يمكن استخدامها معا بشكل فعال لتقييم قدرة أساليب إدارة مختلفةالثانية التعديلات مجمع لاستهداف وتقديم جزيئات fluorescently المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي 1.

تصف البيانات دون تقديم ثلاث مركبات: متجه لتوصيل العقاقير المعروفة باسم ELP ونسختين من ELP تعديل مع الببتيدات اختراق الخلية (SynB1-ELP وتات-ELP) 9. وصفت كل المركبات الثلاث مع tetramethylrhodamine-5-maleimide وتسليمها عبر طريقين الإدارة (في والرابع). وكان الهدف من هذه التجارب لتحديد المرك...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة لتحديد التركيزات النسبية للمركبات fluorescently المسمى داخل وبين الأنسجة أو مجموعات العلاج. على العكس من ذلك، كمية الأنسجة مضان، في حين أن أكثر كثيفة العمالة، يسمح لتقدير مستويات الأنسجة المطلقة من الجزيئات المسمى.

استخدام<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

و خارج الحي متفرقة التحضير Microvessel الهيكل العظمي للتحقيق في التفاعل الأوعية الدموية

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

رسم الخرائط الزمانية المكانية في القدرة على الحركة في<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الاستعدادات للأمعاء

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

بروتين ج-FOS كشف Immunohistological: أداة مفيدة كعلامة للممرات الوسطى تشارك في الاستجابات الفسيولوجية محددة<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; فيفو السابقين</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...