Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

הערה: כל שימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של המרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי. 1. טיפול בבעלי חיים ורקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנהל וקרבה <ol style=";text-align:right...

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

בעוד הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים היא פשוטה בדרך כלל, ההדבקות כמה מושגים בסיסיים וטכניקות יכולות לשפר את הדיוק של מדידות ביו-הפצה. אורכי גל קצרים של ניסיון אור רמה גבוהה של פיזור וספיגה ברוב הרקמות, אשר באופן משמעותי משפיע על השירות של fluorophores-אורך הגל הקצר. fluorophore...

תיוג פלורסנט הוא שיטה מנוצלת בקלות ויעילה לקביעת החלוקה-ביו של תרכובות, באמצעות מגוון של ציוד המשותף במעבדות רבות. Fluorophores זמין באופן נרחב, יחסית לא יקר, מגיע במגוון של אורכי גל, כך מולקולות שכותרתו מרובות ניתן להשתמש בו זמנית ללא הפרעה. לרובם יש fluorophores מגוון של כימיות עבור נטייה לקבוצות תגובתי שונות על תרכובות מטרה, ותהליך הנטייה הוא פשוט בדרך כלל על מרבית סוגי אתרים תגובתי. בנוסף, הציוד הדרוש לשם המדידות של תרכובות שכותרתו fluorescently נפוצים במעבדות רבות. מיקרוסקופים פלורסנט, הדמיה, וסורקים שקופיות יכולים לשמש בנסיבות שונות, מה שהופך את השימוש של תיוג פלורסנט נגיש מאוד. תוויות פלורסנט משמשים לעתים קרובות כדי לקבוע את חלוקת-ביו קינטיקה של תרכובות הן in vivo לשעבר vivo עם מכשירי הדמיה לחיות, כגון Imager ספקטרום IVIS, ועל ידי היסטולוגיה רקמה כמותית 2,3. שימוש הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים באמצעות התקני הדמיה חיה במהלך השנים גדלות בשל קלות שימוש שלהם ואת היכולת ליצור השוואה מדויקת במהירות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו ללא צורך בעיבוד הנוסף של tissues4. עם זאת, בעוד הדמית vivo לשעבר שלם-איבר יכולה לאפשר ניתוח קל והשוואה, זה לא ליצור מדד כמותי של ריכוזי מתחם מוחלטים בתוך רקמה. זאת בשל תופעות פיזור אור בתוך איברים שלמים. מאז פיזור אור (ו, במידה, ספיגה פחותה) משתנה לפי גודל רקמות צפיפות, הדמיה כולו באיברים יכולה לזלזל רמות רקמות באיברים גדולים או צפופים. גיבוש סטנדרטים מתאימים למדידות ריכוז מוחלטות הוא גם קשה כי צריך לחקות את העוביוצפיפות של כל איבר יחיד. מצד השני, הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה קבלת רמות הרקמות היחסיות של סוכן, והוא אידיאלי עבור השוואה ביו-ההפצה היחסית של מולקולות הקשורות מרובות (כגון במחקרי מיקוד סמים). אסטרטגיה חלופית היא להשתמש היסטולוגיה הקרינה כמותי, טכניקה נגזר שיטת autoradiography כמותיים, כדי להשיג רמות רקמות מוחלט של סוכן הבדיקה 5,6. במקום למקם חיה או איבר שלמה לתוך מכשיר דמיון, היסטולוגיה רקמה כמוני דורשת שכל רקמה להיות פרוסה, רכוב על שקופיות, סרק, ונותחה בנפרד. התקנים של סוכן הבדיקה ערוכים ופרוסים באותו עובי כמו דגימות איברים. על ידי גזירה כל האיברים ותקנים באותו עובי, השתנות עקב פיזור או ספיגת האור מתבטלת, ועוצמת הקרינה ברקמות יכול להיות בכושר כדי עקומת סטנדרט לקבוע concent מוחלטמָנָה. אמנם שיטה זו, כאשר נעשה כראוי, הוא כמוני, הוא גם עתירי עבודה כשלה בקלות. בהתחשב באופי מורכב יותר של היסטולוגיה כמותיים העלות הגבוהה יותר באופן משמעותי של עבודה בהשוואת הדמיה כולו באיברים, הוא הופך להיות כדאי לבחון היכן כל תהליך הוא הכי פרקטי להשתמש כאשר בוחן את ההתפלגות ביו של תרכובות שכותרתו fluorescently. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך שיטות אלה יכולים לשמש יחד כדי להשוות את ביו-הפצה יעילה של פוליפפטיד אלסטין דמוי שכותרתו rhodamine (ELP), עם או בלי תוספת של פפטידים התא חודר SynB1 או טאט, דרך אפי (IN) ו תוך ורידי (IV) נתיבי ממשל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

תיוג פלורסנט הוא תהליך ומבוסס לבחינת גורלו של מולקולות שכותרתו תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי הוא במבחנת in vivo. בדיקות ניאון הם שימושיות במיוחד בקביעה-ההפצה ביו של מולקולות גדולות מנוהלות, שבו התוספת של תווית ניאון מולקולות קטנות, ישפיע על קינטיקה או ביו-הפצה של המתחם. מגוון שיטות קיימים לבחון ביו-הפצה להשתנות באופן משמעותי את כמות המאמץ הנדרשת והאם המדידות וכתוצאה מכך הם כמוני מלאים, אבל בשיטות מרובות בשיתוף יכולות לספק מערכת מהירה ויעילה לניתוח ביו-הפצות. Ex vivo הדמיה-איבר שלם היא שיטה שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את הריכוזים היחסיים במהירות של מולקולות ניאון בתוך רקמות ובין סוגים שונים של רקמות או קבוצות הטיפול. שימוש plat הדמיהטופס מיועד-חי או הדמיה כולו באיברים, קרינה בתוך רקמות שלמות ניתן לקבוע ללא עיבוד נוסף, תוך חיסכון בזמן עבודה תוך מתן תמונה מדויקת של ביו-ההפצה הכוללת. תהליך זה הנו אידיאלי בניסויים מנסים לקבוע את הספציפיות רקמות של תרכובת או עבור ההשוואה של תרכובות שונות מרובות. היסטולוגיה רקמו כמוני המצד השני דורשת עיבוד נוסף נרחב של רקמות על מנת ליצור מדד כמותי של התרכובות שכותרתו. כדי להעריך ביו-הפצה מדויקת, כל הרקמות של עניין חייבות להיות פרוסות, סרק, ונותחו ביחס עקומות סטנדרטיות כדי לערוך השוואות בין רקמות או קבוצות. היסטולוגיה רקמו כמוני הוא תקן זהב להחלטת ריכוזים מתחמים מוחלטים בתוך רקמות. כאן אנו מתארים כיצד שתי השיטות ניתן להשתמש יחד ביעילות כדי להעריך את היכולת של שיטות ממשל שונות בתnd שינויים במתחם למקד ולספק מולקולות שכותרתו fluorescently למערכת העצבים המרכזית 1.

הנתונים שלהלן מתארים את המסירה של שלושת המתחמים: וקטור להולכת תרופות המכונה ELP ואת שתי גרסאות של ELP שונה עם פפטידים חודר תאים (SynB1-ELP ו טאט-ELP) 9. כל שלושת המתחמים תויגו עם tetramethylrhodamine-5-maleimide ונמסרו באמצעות שני מסלולים הממשל (IN ו- IV). מטרת המחקרים הללו הייתה לקבוע אילו ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכותרתו.

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...