Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

MERK: All bruk av dyr i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Mississippi Medical Center. 1. Behandling av dyr og vev <ol><li> Administrasjon og Sacrifice <ol><li> Bedøve dyrene ved anvendelse av 3% isofluran i 5 minutter og verifisere anestesidybden ved å observere fravær av tå-klemme refleks. Påfør veterinær salve til øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. </li><li> Vei dyret og pipetter a / kg dose av enten rhod...

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

Mens ex vivo hel-organ bildebehandling er generelt grei, kan det tilslutning til noen grunnleggende begreper og teknikker forbedre nøyaktigheten av bio-distribusjons målinger. Korte bølgelengder av lys oppleve en høy grad av spredning og absorpsjon i de fleste vev, som i betydelig grad påvirker nytten av kort bølgelengde fluorophores de. Disse fluoroforer har begrenset anvendelse i dype vev studier, men de har vært brukt effektivt i eksperimenter ser på overflaten vev eller inn i øyet. Omvendt, lange b...

Fluorescerende merking er en lett utnyttes og effektiv fremgangsmåte for å bestemme bio-fordeling av forbindelser, ved hjelp av et utvalg av utstyr som er felles for mange laboratorier. Fluoroforer er allment tilgjengelig, relativt billig, og kommer i en rekke forskjellige bølgelengder, slik at flere merkede molekyler kan benyttes samtidig uten forstyrrelser. De fleste fluoroforer har en rekke kjemikalier for konjugering til forskjellige reaktive grupper på målforbindelser, og prosessen med konjugering er vanligvis en enkel prosess for de fleste typer av reaktive seter. I tillegg er det utstyr som kreves for målingene av fluorescensmerkede forbindelser er vanlig i mange laboratorier. Fluorescent mikroskoper, kameraer og lysbilde skannere kan alle brukes i ulike situasjoner, som gjør bruk av fluorescerende merking svært tilgjengelig. Fluorescerende markører blir ofte brukt til å bestemme den biologiske fordeling og kinetikken av forbindelser både in vivo og ex vivo med live bildebehandlingsenheter, for eksempel IVIS Spectrum Imager, og ved kvantitativ vev histologi 2,3. Bruken av ex vivo hel-organ avbildning ved hjelp live bildebehandlingsenheter har økt over tid på grunn av sin brukervennlighet og evne til raskt å lage en nøyaktig sammenligning av de relative konsentrasjoner av merkede forbindelser uten at den videre behandlingen av tissues4. Men mens ex vivo hel-organ bildebehandling kan gi rom for enkel analyse og sammenligning, det ikke genererer et kvantitativt mål for absolutte sammensatte konsentrasjoner i en vev. Dette skyldes lysspredning effekter i intakte organer. Siden lysspredning (og, i mindre grad, absorbans) varierer fra vev størrelse og tetthet, kan hel-organ avbildning under vevsnivåer i store eller tette organer. Formulering aktuelle standarder for absolutte konsentrasjonsmålinger er også vanskelig fordi man må etterligne tykkelsenog densitet på hvert enkelt organ. På den annen side, er hel-organ avbildning en rask metode for å skaffe de relative vevsnivåer av et middel, og det er ideell for å sammenligne den relative biologiske fordeling av flere beslektede molekyler (slik som i legemiddel rettet mot studier). En alternativ strategi er å benytte kvantitativ fluorescens histologi, en teknikk som er avledet fra metoden til kvantitativ autoradiografi, for å oppnå absolutte vevsnivåer av et testmiddel 5,6. Snarere enn å plassere en hel dyr eller organ i en forestillingsevne enhet, krever kvantitativ vev histologi at hvert vev være skiver, montert på lysbilder, skannet, og analysert individuelt. Standarder av testmidlet fremstilles og skiver med samme tykkelse som de organprøvene. Ved å kutte alle organer og standarder til den samme tykkelse, er variasjonen på grunn av lysspredning eller absorbans elimineres, og vev fluorescens intensitet kan være egnet til å standardkurven for å bestemme absolutte concentrasjon. Selv om denne fremgangsmåten, når det gjøres riktig, er kvantitativ, er det også arbeidskrevende og lett misbrukes. Gitt mer komplekse natur av kvantitative histologi og betydelig høyere pris på arbeidskraft sammenlignet med hel-organ bildebehandling, blir det verdt å undersøke hvor hver prosess er mest praktisk å bruke når undersøke bio-fordeling av fluorescensmerkede forbindelser. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan disse metodene kan brukes sammen for effektivt å sammenligne den biologiske fordeling av rhodaminmerkede Elastin-lignende polypeptid (ELP), med eller uten tilsetning av SynB1 eller Tat-cellepenetrerende peptider, via intranasal (IN) og intravenøs (IV) administrasjonsveier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Fluorescerende merking er en godt etablert prosess for å undersøke skjebnen av merkede molekyler under forskjellige eksperimentelle betingelser både in vitro og in vivo. Fluorescerende prober er spesielt nyttige for å bestemme bio-fordelingen av administrert store molekyler, hvor tilsetningen av en liten-molekyl fluorescerende markør antas ikke å påvirke kinetikken eller bio-fordeling av forbindelsen. En rekke metoder eksisterer for å undersøke bio-fordeling som varierer betydelig i mengden av anstrengelse som kreves, og hvorvidt de resulterende målingene er fullstendig kvantitativt, men ved hjelp av flere metoder i kombinasjon kan gi en hurtig og effektivt system for å analysere bio-distribusjoner. Ex vivo hel-organ avbildning er en metode som kan brukes til raskt å sammenligne de relative konsentrasjoner av fluorescerende molekyler i vev og mellom flere typer vev eller behandlingsgruppene. Ved hjelp av en avbildning platskjema designet for live-dyr eller hel-organ imaging, fluorescens innen intakte vev kan bestemmes uten videre behandling, noe som sparer tid og arbeid samtidig som det gir et riktig bilde av den samlede bio-distribusjon. Denne prosessen er ideelt i forsøk forsøker å bestemme vevsspesifisiteten av en forbindelse eller for sammenligning av flere forskjellige forbindelser. Kvantitativ vev histologi på den annen side krever omfattende videre behandling av vev for å skape et kvantitativt mål på de merkede forbindelser. For å vurdere bio-fordeling nøyaktig, må alle vev av interesse være skiver, skannes, og analysert i forhold til standardkurver for å foreta sammenligninger mellom vev eller grupper. Kvantitativ vev histologi er gullstandarden for å bestemme absolutte sammensatte konsentrasjoner i vev. Her beskriver vi hvordan begge metoder kan benyttes effektivt sammen for å vurdere evnen til forskjellige administrasjonsmetoder and sammensatte modifikasjoner til målet og levere fluorescerende merkede molekyler til sentralnervesystemet 1.

Dataene nedenfor beskriver levering av tre forbindelser: en narkotika-levering vektor kjent som ELP og to versjoner av ELP modifisert med celle-gjennomtrengende peptider (SynB1-ELP og Tat-ELP) 9. Alle tre forbindelser ble merket med tetramethylrhodamine-5-maleimide og levert via to administrasjonsveier (IN og IV). Målet med disse eksperimentene var å bestemme hvilken forbindelse og tilførselsvei vil resultere i den beste penetrasjon inn i sentralnervesystemet (CNS) 3. <p class="jove_content"...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo hel-organ avbildning er en hurtig metode for å bestemme de relative konsentrasjoner av fluorescensmerkede forbindelser innenfor og mellom vev eller behandlingsgruppene. Omvendt, kvantitativ fluorescens histologi, mens mer arbeidskrevende, gjør det mulig for kvantifisering av de absolutte vevsnivåer av merkede molekyler.

Bruken av<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hel-organ Imaging og kvantitativ Tissue Histologi fastslår Bio-distribusjon av fluorescensmerkede molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Det Ex vivo Isolert Skeletal Microvessel Forberedelse for etterforskning av vaskulær reaktivitet

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Hud og Live-avbildning av Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartlegging av Motilitet i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Forberedelser av tarmen

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttig verktøy som en markør av Central Pathways involvere seg i det fysiologiske responser<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...