Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

OBS: All användning av djur i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Mississippi Medical Center. 1. Behandling av djur och vävnader <ol><li> Administration och offer <ol><li> Söva djuren med användning av 3% isofluran under 5 min och kontrollera djupet av anestesi genom att observera frånvaron av toe-nypa reflex. Applicera veterinär salva till ögonen för att förhindra torrhet under narkos. </li><li> Väg djuret och pipe...

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

Medan ex vivo hela organavbildning är i allmänhet okomplicerad, kan ansluta sig till några grundläggande begrepp och tekniker förbättra mätnoggrannheten bio-distributions. Korta våglängder av ljus erfarenhet en hög grad av spridning och absorbansen i de flesta vävnader, vilket avsevärt påverkar redskaps av de kortvåglängds fluoroforer. Dessa fluoroforer har begränsad användning i djupvävnadsstudier, men de har använts effektivt i experiment tittar på ytan vävnader eller i ögat. Omvänt, l?...

Fluorescensmärkning är en lätt utnyttjas och effektiv metod för bestämning av bio-fördelning av föreningar, med användning av en serie anordningar, som är gemensam för många laboratorier. Fluoroforer är allmänt tillgängliga, relativt billiga, och finns i en mängd olika våglängder, så att flera märkta molekyler kan användas samtidigt utan interferens. De flesta fluoroforer har en rad kemiska för konjugering till olika reaktiva grupper på målföreningar, och processen för konjugering är i allmänhet enkelt för de flesta typer av reaktiva ställen. Dessutom, den utrustning som krävs för mätningarna av fluorescensmärkta föreningar är vanliga i många laboratorier. Fluorescerande mikroskop, kameror och glida skannrar kan alla användas i olika sammanhang, vilket gör användningen av fluorescensmärkning hög tillgänglighet. Fluorescerande markörer används ofta för att bestämma bio-distribution och kinetik av föreningar både in vivo och ex vivo med levande bildenheter, t.ex. IVIS Spectrum Imager och genom kvantitativ vävnads histologi 2,3. Användningen av ex vivo hela organ avbildning med levande bildenheter har ökat över tiden på grund av sin användarvänlighet och förmåga att snabbt skapa en korrekt jämförelse av de relativa koncentrationerna av märkta föreningar utan att kräva ytterligare bearbetning av tissues4. Men medan ex vivo hela organavbildning kan möjliggöra enkel analys och jämförelse, det genererar inte ett kvantitativt mått på absoluta föreningskoncentrationer inom en vävnad. Detta beror på att ljusspridande effekt inom intakta organ. Eftersom ljusspridning (och, i mindre utsträckning, absorbans) varierar beroende på vävnadens storlek och densitet, kan hel-organavbildningsskatta vävnadsnivåer i stora eller täta organ. Att formulera lämpliga normer för mätning absolut koncentration är också svårt eftersom man måste efterlikna tjocklekoch densiteten hos varje enskilt organ. Å andra sidan, är hela organavbildnings en snabb metod för att få de relativa vävnadsnivåer av en agent, och det är idealiskt för att jämföra den relativa biologiska fördelningen av flera relaterade molekyler (såsom i läkemedelsmålsökande studier). En alternativ strategi är att utnyttja kvantitativ fluorescens histologi, en teknik som härrör från metod för kvantitativ autoradiografi, för att erhålla absoluta vävnadsnivåer av ett testmedel 5,6. Snarare än att placera en hel djur eller organ i en föreställa enhet kräver kvantitativ vävnad histologi att varje vävnad skivas, monterades på objektglas, skannade och analyseras individuellt. Standarder av testmedlet framställs och skivade vid samma tjocklek som samplar organ. Genom att skära alla organ och standarder till samma tjocklek, är variationen på grund av ljusspridning eller absorption elimineras, och vävnadsfluorescensintensitet kan passa med standardkurvan för att bestämma absolut concentransonera. Även om denna metod, när det görs på rätt sätt, är kvantitativt, är det också arbetsintensiv och lätt misshandlat. Med tanke på den mer komplexa karaktär kvantitativ histologi och kraftigt ökade kostnader för arbetskraft jämfört med hela organavbildning, blir det värt att undersöka var varje process är mest praktiskt att använda när man undersöker den biologiska fördelningen av fluorescerande föreningar. Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av hur dessa metoder kan användas tillsammans för att på ett effektivt sätt jämföra den biologiska fördelningen av rodamin-märkt Elastin liknande polypeptid (ELP), med eller utan tillsats av de SynB1 eller Tat cellpenetrerande peptider, via intranasal (IN) och intravenösa (IV) administrationssätt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Fluorescerande märkningen är en väletablerad process för att undersöka vad som händer med märkta molekyler under olika experimentella betingelser både in vitro och in vivo. Fluorescerande prober är speciellt användbara vid bestämning av biologiska fördelningen av administrerade stora molekyler, där tillsatsen av en liten molekyl fluorescerande markör är osannolikt att påverka kinetiken eller bio-fördelning av föreningen. Ett antal olika metoder finns för att undersöka biologisk distribution som varierar betydligt i mängden ansträngning som krävs och huruvida de resulterande mätningarna är helt kvantitativa, men med användning av flera olika metoder i samband kan tillhandahålla ett snabbt och effektivt system för att analysera bio-fördelningar. Ex vivo hel-organavbildnings är en metod som kan användas för att snabbt jämföra de relativa koncentrationerna av fluorescerande molekyler inom vävnader och mellan flera olika typer av vävnader eller behandlingsgrupper. Använda en avbildning platform för levande djur eller hela organavbildning, fluorescens inom intakta vävnader kan bestämmas utan ytterligare bearbetning, vilket sparar tid och arbete, samtidigt som en korrekt bild av den totala biologiska distribution. Denna process är idealisk i experiment som försöker att bestämma vävnadsspecificiteten av en förening eller för jämförelse av multipla olika föreningar. Kvantitativ vävnads histologi å andra sidan kräver omfattande ytterligare behandling av vävnader i syfte att skapa ett kvantitativt mått på de märkta föreningarna. Att exakt bedöma bio-distribution måste alla vävnader av intresse skivas, skannas och analyseras i förhållande till standardkurvor för att göra jämförelser mellan vävnader eller grupper. Kvantitativ vävnads histologi är den gyllene standarden för att bestämma absoluta föreningskoncentrationer i vävnader. Här beskriver vi hur båda metoderna kan användas tillsammans på ett effektivt sätt för att bedöma förmågan hos olika administrationsmetoder and sammansatta modifieringar för att rikta och leverera fluorescerande molekyler till det centrala nervsystemet 1.

Uppgifterna nedan beskriver leverans av tre föreningar: a drug delivery vektor kallas ELP och två versioner av ELP modifierad med cellpenetrerande peptider (SynB1-ELP och Tat-ELP) 9. Samtliga tre föreningar märktes med tetrametylrodamin-5-maleimid och levereras via två administrationsvägar (IN och IV). Målet med dessa försök var att bestämma vilken förening och administrationsvägen skulle resultera i den bästa penetrationen in i det centrala nervsystemet (CNS) 3. <p class="jove_con...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo hel-organ avbildning är en snabb metod för att bestämma de relativa koncentrationerna av fluorescensmärkta föreningar inom och mellan vävnader eller behandlingsgrupper. Omvänt, kvantitativ fluorescens histologi, medan mer arbetsintensiv, möjliggör kvantifiering av de absoluta vävnadsnivåer av märkta molekyler.

Användningen av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Hela organ Imaging och Kvantitativ Tissue histologi att bestämma Bio-fördelningen av fluorescerande molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Användning av Protease Fluorescent Detection Kit Avgöra Protease aktivitet

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Den Ex vivo Isolerad Skeletal mikrokärlsbildning Förberedelse för undersökning av vaskulär reaktivitet

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Kultur av Mouse embryonala Hud-och Live-avbildning av Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartläggning av motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Förberedelser tarm

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...