Name: using x-ray crystallography, biophysics, and functional assays to determine the mechanisms governing t-cell receptor recognition of cancer antigens
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00
Duration: 9 min 53 s
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BM está apoyado por una beca de investigación de cáncer Reino Unido doctorado. AG es apoyado por una beca de Ciencias de la Vida Red de Investigación Gales del doctorado. VB es apoyado por una beca de investigación de cáncer Gales del doctorado. DKC es un Fideicomiso de Investigación de Desarrollo de Carrera Fellow Wellcome (WT095767). AKS es un investigador del Wellcome Trust. GHM es financiado por una Red de investigación en ciencias de la vida Gales y Tenovus cuidado del cáncer de beca de doctorado conjunta. Agradecemos al personal de Diamond Light Source para proporcionar facilidades y apoyo.

1. Expresión de proteínas <ol><li> Hacer construcciones génicas para la generación de TCR y pHLAs solubles, como se ha descrito en detalle previamente 17, 18. Diseño de cada construcción con un &#39;BamH1 y un 3&#39; 5 sitio EcoR1 de restricción para la inserción en el vector pGMT7. </li><li> Transformar coli Rosetta pLysS E. (DE3) con un vector de plásmido derivado de pGMT7 que contiene la secuencia que codifica la proteína de interés mediante la incubación de 1 l de 50 a 200 ng / l de plásmido con 5 l de E. coli durante 5 min a 4 ° C , 2 min a 42 ° C, y 5 min a 4 ° C, y la placa durante la noche a 37 ° C en una placa de agar LB suplementado con 50 mg / l de carbenicilina. </li><li> Recoger colonias individuales y crecer a 37 ° C y 220 rpm en 30 ml de medio TYP (16 g / L de triptona, 16 g / extracto de levadura L, y 5 g / L HK 2 O 4) suplementado con 100 carbenicilina mu M hasta que la suspensión alcanza una de ópticonsity (OD 600) de entre 0,4 y 0,6. </li><li> Inducir la producción de proteína en un ml alícuota 5 mediante la introducción de 0,5 mM isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 h. Mantenga 20 l de suspensión con y sin inducción para electroforesis con dodecilsulfato sódico en gel de poliacrilamida análisis (SDS-PAGE) y teñir el gel. </li><li> Añadir cultivos iniciadores a 1 L de TYP suplementado con carbenicilina 100 mM y crecer células como se describe anteriormente en el paso 1.3 hasta que la suspensión alcanza un OD 600 entre 0,4 y 0,6. </li><li> Inducir la expresión de la proteína durante 3 h con IPTG 0,5 mM. Centrifugar las células durante 20 min a 3.000 xg y se vierte el sobrenadante con cuidado. </li><li> Disolver el precipitado en 40 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,1; 10 mM de cloruro de magnesio, MgCl 2; NaCl 150 mM; y 10% de glicerol), se somete a ultrasonidos en hielo durante potencia 30 min a 60% utilizando intervalo de un 2 s , y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 30 min con 0,1 g / L de DNasa. </li><li> Se trata el SUSpensión que contiene las proteínas en forma de cuerpos de inclusión (IB) con 100 ml de tampón de lavado (0,5% de Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; NaCl 100 mM; y EDTA 10 mM). </li><li> Centrifugar la muestra durante 20 min a 4 ° C y 8.000 xg y se vierte el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender el precipitado en 100 ml de tampón de resuspensión (Tris 50 mM, pH 8,1; NaCl 100 mM; y 10 mM EDTA, pH 8,1), se centrifuga como antes a 8000 xg, y se vierte fuera el sobrenadante con cuidado. </li><li> Finalmente, disolver el precipitado en 10 ml de tampón de guanidina (6 M de guanidina; 50 mM de Tris, pH 8,1; EDTA 2 mM, pH 8,1, y NaCl 100 mM) y medir la concentración de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro. </li></ol> 2. pHLA y TCR replegamiento <ol><li> Para los repliega pHLA, la mezcla 30 mg de HLA-A2 (o HLA-A2 con una etiqueta de biotina) IBs, 30 mg de β2m IBs, y 4 mg de péptido durante 30 minutos a 37 ° C en un baño de agua en un volumen final de 6 ml de tampón de guanidina con ditiotreitol 10 mM(TDT). </li><li> Iniciar replegamiento de proteínas mediante la dilución de la mezcla anterior en 1 L de un tampón de HLA de replegamiento pre-enfriado (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM de L-arginina; EDTA 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; y cistamina 4 mM). </li><li> Dejar el HLA repliegue de agitar a 4 ° C durante 3 h y luego se transfiere en una kDa MWCO 12,4 (peso molecular de corte) del tubo de diálisis y se dializa dos veces durante 24 h contra 20 L de Tris 10 mM, pH 8,1. </li><li> Para los repliega TCR, la mezcla 30 mg de TCR de cadena α IBs y 30 mg de TCR de cadena β IBs durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua en 6 ml de tampón de guanidina suplementado con DTT 10 mM. </li><li> Iniciar replegamiento de proteínas mediante la dilución de la mezcla de TCR desnaturalizado en 1 L de un tampón de TCR replegamiento pre-enfriado (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea; EDTA 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; y cistamina 4 mM) durante 3 marido. </li><li> Transferir el replegamiento en un tubo de diálisis 12,4 kDa MWCO y diálisis dos veces durante 24 h contra 20 L de Tris 10 mM, pH 8,1. </li><li> Filtrar tanto el TCR o pHLA refedad utilizando un filtro de membrana de 0,45 micras para las etapas de purificación. </li></ol> 3. La purificación por Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) <ol><li> Cargar la preparación de replegamiento filtrada (ya sea pHLA o TCR) en un 7,9 ml, 50 columna de resina de intercambio de aniones micras pre-equilibró con 20 ml de Tris 10 mM, pH 8,1 en un sistema de cromatografía flexible e intuitiva. </li><li> Eluir la proteína en 5 ml / min con un gradiente de sal (NaCl 0 a 500 mM en Tris 10 mM, pH 8,1, más de 8 volúmenes de columna) y recoger las fracciones de 1 ml. </li><li> Analizar las fracciones correspondientes a la proteína de interés por SDS-PAGE, en común las fracciones que contienen la proteína de interés juntos, y concentrarlos a 500 l con 10-kDa MWCO 20 o 10 kDa MWCO 4 por centrifugación durante 20 min a 4.000 xg , descartando el flujo a través. </li><li> Cargar las preparaciones de proteínas concentradas en un bucle de 2 ml por inyección en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño de 24 ml pre-equilibrada con la aplicacióntampón ropriate elución: solución salina tamponada con fosfato (PBS), HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; mM EDTA 3,4, y 0,005% de tensioactivo), o tampón de cristal (10 mM Tris, pH 8,1, y NaCl 10 mM ). </li><li> Eluir las proteínas a una velocidad de flujo de 0,5 mL / min durante 1 volúmenes de columna; recoger fracciones de 1 ml que contenían la proteína de interés verificado por SDS-PAGE. NOTA: Estos métodos se utilizaron para generar los TCR solubles PMEL17 TCR y gp100, así como todos los pHLAs utilizados en este estudio: HLA-A * 0201 con YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), o YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Superficie Plasmon Resonance (SPR) Análisis <ol><li> Realizar análisis de unión en equilibrio, o análisis termodinámico utilizando un sistema de análisis de la interacción molecular, equipado con un chip sensor CM5 19. </li><li> Activar el chip CM5 por fsi- una mezcla 1: 1 de 100 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 3- mM 1-etil-(3-dimetilpropil) -carboiimide 400 (EDC) durante 10 min a un caudal de 10 l / min y a 25 ° DO. </li><li> Cargar aproximadamente 5000 unidades de respuesta (RU) de estreptavidina (110 l de 200 g / ml en acetato 10 mM, pH 4,5) por unión covalente a la superficie del chip en todas las cuatro celdas de flujo y el uso de 100 l de clorhidrato de etanolamina 1 M para desactivar cualquier grupo reactivo restante. </li><li> Pareja de aproximadamente 500 a 600 RU de pHLA, en ~ 1 mM en tampón comercial (proporcionado por el fabricante), al chip sensor CM5 a una velocidad de flujo lenta de 10 l / min para asegurar una distribución uniforme sobre la superficie del chip. </li><li> Saturar la superficie del chip con biotina 1 mM en tampón comercial (proporcionado por el fabricante) durante 60 s. </li><li> Inyectar diez diluciones en serie de los TCR solubles más de las células de flujo correspondientes a una alta velocidad de flujo de 30 l / min a 25 ° C. </li><li> Calcular la constante de unión de equilibrio de(K D (E)) valores usando un ajuste no lineal de la curva (y = (P1X) / (P2 + x)) 20. NOTA: Las unidades de respuesta y =, x = concentración analista, P1 = r max, P2 = KD. </li><li> Realizar un análisis de la cinética suponiendo una relación 1: 1 de unión de Langmuir y ajustar los datos utilizando un algoritmo de ajuste mundial en el paquete de software 2. </li><li> Realizar termodinámica experimentos mediante la repetición de este método a las siguientes temperaturas: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, y 30 ° C 19. </li><li> Utilice los valores K D determinados por SPR a diferentes temperaturas para calcular? G ° utilizando la ecuación termodinámica estándar (? G ° = -RTlnK D) 19. NOTA: R = constante de los gases, T = temperatura en K, ln = logaritmo natural. </li><li> Calcular los parámetros termodinámicos de acuerdo con la ecuación de Gibbs-Helmholtz (? G? H ° = - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Trazar las energías de enlace libres,? G ° (? G ° = -RTlnK D), en contra de la temperatura (K) usando una regresión no lineal para adaptarse a la ecuación de tres parámetros (y =? H + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. NOTA: y = temperatura en K, x =? G °. </li></ol> 5. calorimetría de titulación isotérmica (ITC) <ol><li> Realizar CCI experimentos utilizando un calorímetro de titulación isotérmica. Inyectar 30 M pHLA en la célula calorímetro y la carga 210 M TCR soluble en la jeringa. Utilice las siguientes condiciones: tampón HEPES 20 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM. </li><li> Realizar 20 inyecciones de TCR, cada uno de un volumen de 2 l. Calcula? H y K D utilizando el software de análisis. </li></ol> 6. La cristalización, Colección de datos de difracción, y el refinamiento del modelo <ol><li> Realizar ensayos de cristalización utilizando un robot de cristalización. </li><li> Crecimiento de cristales de VAPo de difusión a 18 ° C a través de la técnica de la gota que se sienta en una placa de 96 pocillos con un depósito que contiene 60 l de tampón de cristalización (aguas madres) 21. </li><li> Se concentra la pHLA soluble a aproximadamente 10 mg / ml (0,2 mM) en tampón de cristal por girando a 3.000 xg en un peso molecular de 10 kDa concentrador centrífugo de corte. </li><li> Para las estructuras co-complejo, mezclar el TCR y pHLA en una relación 1: 1 molar para obtener una solución de proteína a aproximadamente 10 mg / ml (0,1 mM). </li><li> Añadir 200 nL de pHLA solo, o el 1: 1 relación molar de mezcla de TCR y pHLA, a 200 nL de cada solución de reserva de la pantalla de cristalización usando un robot de cristalización y la puntuación para los cristales bajo un microscopio después de 24 h, 48 h, 72 h, y después una vez a la semana. </li><li> monocristales cosecha montándolos manualmente en crio-bucles bajo el microscopio y los crio-enfriar sumergiendo y su almacenamiento en nitrógeno líquido (100 K). NOTA: Los cristales de la carga tiene un poco de prácTice, y decidir que los cristales son lo suficientemente bueno para la recopilación de datos viene con la experiencia. Como regla general, cuanto más grande y más regular del cristal, mejor. </li><li> Recopilar datos en una corriente de gas nitrógeno a 100 K. NOTA: Estos datos se adquirió en el Diamond Light Source (DLS) instalación de sincrotrón nacional de ciencia en el Reino Unido. </li><li> Analizar los datos mediante la estimación de las intensidades de reflexión con xia2 utilizando tanto MOSFLM 22 y XDS paquetes de 23, y luego escalar los datos con SCALA o sin rumbo 24 y el paquete CCP4 25. </li><li> Resolver las estructuras con reemplazo molecular usando PHASER 26. </li><li> Ajustar el modelo con FÚLICA 27 y refinar el modelo con REFMAC5 28. </li><li> Preparar representaciones gráficas con PyMOL 29. </li><li> Calcular los contactos utilizando el &quot;contacto&quot;programa en el paquete CCP4. Use un 4 Å de corte para de van der Waals contactos y un 3,4 Å de corte para los enlaces de hidrógeno y puentes de sal. </li><li> Calcular la superficie complementariedad con el programa &quot;SC&quot; en el paquete CCP4. </li><li> Calcular el ángulo de cruce del complejo TCR-pHLA, como se describe 30. NOTA: Para este estudio, los datos de reflexión y coordenadas modelo final fueron depositados en la base de datos PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V AP: 5EU6, A2-YLE AP: 5EU3, A2-YLE-3A AP: 5EU4, y A2 -YLE 5A-AP: 5EU5). </li></ol>

The authors have no conflicts of interest or competing financial interests.

Los protocolos descritos aquí proporcionan un marco para la disección molecular y celular de las respuestas de células T en el contexto de cualquier enfermedad humana. Aunque el cáncer fue el principal foco de este estudio, hemos utilizado enfoques muy similares a investigar las respuestas de células T a los virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 y durante la autoinmunidad 38, 39, 40. Además, hemos utilizado estas técnicas más ampliamente para comprender los principios moleculares que rigen el reconocimiento de las células T antígeno 2, 19, 41, 42. De hecho, la naturaleza impredecible de modificaciones al péptido residuos, incluso aquellosfuera de la de los residuos de contacto TCR, el reconocimiento de los efectos de las células T tiene implicaciones importantes para el diseño de péptidos heteróclitos. Estos descubrimientos han contribuido directamente al desarrollo de nuevas terapias de células T, incluyendo vacunas de péptidos 6, 43 y los TCR de alta afinidad artificiales 3, 4, 5, 20, 44, así como de diagnóstico mejorado 45, 46, 47. Los pasos críticos en el protocolo La generación de una proteína altamente puro, funcional es esencial para todos los métodos descritos en el presente documento. Modificaciones y solución de problemas Las dificultades en la generación de proteína altamente pura a menudo se refieren a la expresión de muypuro al, insoluble IBs desde el sistema de expresión de E. coli. Por lo general, la modificación del protocolo de expresión (por ejemplo, induciendo a diferentes densidades ópticas, el uso de diferentes cepas de E. coli, o el uso de diferentes formaciones de medios de comunicación) resuelve estos problemas. Las limitaciones de la técnica Estas técnicas utilizan moléculas de proteínas solubles (TCR y pHLA) que se expresan normalmente en la superficie celular. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los resultados estructurales / biofísicas son consistentes con los enfoques celulares para confirmar importancia biológica. Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos A través del uso de la cristalografía de rayos X y biofísica justificados a través del análisis funcional, nosotros y otros han demostrado que los TCR específicos para epítopos de cáncer se caracterizan generalmente por afinidades de unión de baja 48. Esta baja afinidad TCR puede ayudar a explicar por qué las células T are no naturalmente eficaz en la limpieza cáncer. estructuras atómicas de alta resolución de complejos entre los TCR contra el cáncer y los antígenos tumorales afines están empezando a revelar las bases moleculares de esta afinidad débil. Por otra parte, estos estudios son útiles para determinar los mecanismos que subyacen a las intervenciones terapéuticas destinadas a superar este problema, la siembra de las mejoras futuras 16. En este estudio, hemos examinado la primera estructura de un αβTCR de origen natural en un complejo con gp100 HLA-A * 0201-Restringido epítopo melanoma. La estructura, en combinación con un examen biofísico en profundidad, reveló el modo de unión global de la interacción. También hemos descubierto un interruptor inesperado molecular, que se produjo en una forma mutada del péptido, que abrogó unión TCR (evaluada usando resonancia de plasmón de superficie) y el reconocimiento de las células T CD8 + (experimentos funcionales). Sólo fue posible demostrar que este nuevo mecanismo de PRESENTACIÓN antígeno HLAsobre el uso de los métodos de alta resolución descritos. Las aplicaciones futuras o direcciones después de dominar esta técnica En general, nuestros resultados demuestran el poder de la cristalografía de rayos X y los métodos biofísicos cuando se combina con análisis funcionales robustos. El uso de estos enfoques, es posible diseccionar los mecanismos moleculares precisos que gobiernan el reconocimiento de antígenos de células T. De hecho, también es posible usar este enfoque para resolver la estructura de TCR no ligado, lo que demuestra cómo los cambios conformacionales pueden jugar un papel durante la discriminación antígeno 49, 50, 51. Una mejor comprensión de la naturaleza altamente compleja y dinámica que sustenta la interacción TCR-pHLA también tiene implicaciones obvias para el diseño de la terapia. Ser capaz de &quot;ver&quot; directamente las moléculas que están siendo dirigidas terapéuticamente, así como el efecto que tienen sobre modificaciones recognitio antígenon, mejorará claramente el desarrollo de estos medicamentos en el futuro. En este estudio, mostramos que incluso cambios en un único residuo de péptido que no está fuertemente comprometidos por un TCR pueden transmitir de forma impredecible cambios estructurales de otros residuos en el péptido HLA-atado, que, a su vez, altera drásticamente el reconocimiento de células T. Una comprensión más completa de los mecanismos moleculares empleados durante el reconocimiento de antígenos de células T será enormemente beneficiosa en el diseño de futuras terapias para una amplia gama de enfermedades humanas.

La cristalografía de rayos X ha sido, y seguirá siendo, una técnica extremadamente poderosa para entender la naturaleza de las interacciones ligando-receptor. Mediante la visualización de estas interacciones en detalle atómico, no sólo es posible divulgar los mecanismos moleculares que regulan muchos procesos biológicos, pero también es posible alterar directamente las interfaces de contacto de beneficio terapéutico. Junto con técnicas como la resonancia de plasmones superficiales y la calorimetría de titulación isotérmica (por nombrar sólo un par), tales modificaciones pueden ser analizados de vista biofísico para evaluar el impacto directo sobre la afinidad de unión, la cinética de interacción, y la termodinámica. Por último, mediante la realización de experimentos funcionales en los tipos de células relevantes, una imagen detallada del impacto molecular y funcional de las modificaciones a las interacciones receptor-ligando se puede extraer, proporcionando información sobre el mecanismo muy específico. En general, estos tipos de métodos proporcionan una imagen atómica resolución que permite al disuadir<html> minación de cómo los sistemas biológicos trabajar, con las consiguientes repercusiones sobre los avances diagnósticos y terapéuticos. Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente estas técnicas para estudiar los receptores que median la inmunidad de células T humanas a los patógenos y cáncer, en la autoinmunidad, y durante el trasplante. Aquí, nos concentramos en la respuesta de células T CD8 + humano al cáncer, mediada por una interacción entre el receptor de células T (TCR) y los péptidos derivados del tumor restringido por el antígeno leucocitario humano (HLA) (pHLA). Esto es importante porque, aunque las células T CD8 + son capaces de dirigirse a las células cancerosas, nosotros y otros han demostrado previamente que los TCR contra el cáncer subóptima se unen a su pHLA afines 1, 2. Por lo tanto, muchos laboratorios han intentado alterar o bien el TCR 3, 4, 5 o el ligando de péptido 6,class = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8 con el fin de aumentar la inmunogenicidad y a mejores células de cáncer objetivo. Sin embargo, estos enfoques no siempre son eficaces y pueden tener efectos secundarios graves, incluyendo toxicidad fuera de objetivo 4, 9, 10. La investigación adicional explorar los mecanismos moleculares que rigen el reconocimiento de las células T de los antígenos del cáncer será de vital importancia para superar estas deficiencias. En el presente estudio, nos centramos en las respuestas contra células de melanoma autólogas de células T CD8 + específicas para un fragmento del antígeno de diferenciación de melanocitos glicoproteína 100 (gp100), gp100 280-288, presentados por HLA-A * 0201 (el más comúnmente -expresada pHLA humano de clase I). Este antígeno ha sido un objetivo ampliamente estudiada para la inmunoterapia del melanoma y se ha desarrollado como un denominado péptido &quot;heteroclitic&quot; en el que una valina sustituye a la alaninaen la posición 9 de anclaje para mejorar la estabilidad pHLA 11. Este enfoque se utilizó para mejorar la inducción de CTLs melanoma reactiva in vitro y se ha utilizado con éxito en ensayos clínicos 12. Sin embargo, las modificaciones de los residuos de péptidos pueden tener efectos impredecibles sobre la especificidad de células T, demostrado por la pobre eficacia de la mayoría de los péptidos heterolitic en la clínica 6, 13. De hecho, otra forma heteróclita de gp100 280-288, en el que resto de péptido Glu3 sustituido por Ala, abrogó reconocimiento por parte de una población policlonal de gp100 280-288 células T específicos de 14, 15. Hemos demostrado previamente que incluso pequeños cambios en los residuos de péptido de anclaje pueden alterar sustancialmente el reconocimiento de las células T de manera impredecible 6, 16. Por lo tanto, el estudio se centró en la construccióning una imagen más detallada de cómo las células T CD8 + reconocen gp100 y cómo las modificaciones de la interacción entre el TCR y pHLA podría afectar esta función. Aquí, hemos generado formas muy puras, solubles de dos TCR específicas para gp100 280-288 presentado por HLA-A * 0201 (A2-YLE), así como las formas naturales y alterados de pHLA. Estos reactivos se utilizaron para generar cristales de proteínas para resolver la estructura atómica ternaria de un TCR humano en complejo con la forma de heteroclitic A2-YLE, así como dos de los pHLAs mutantes en forma no ligada. A continuación, utiliza un enfoque de exploración de péptidos para demostrar el impacto de las sustituciones de péptidos de TCR mediante la realización de experimentos en profundidad biofísicos. Por último, hemos generado una línea de células T CD8 + genéticamente modificado, re-programado para expresar uno de los TCR-A2-YLE específica, con el fin de realizar experimentos funcionales para probar el impacto biológico de las diversas modificaciones de péptidos. Estos datos demuestran que incluso modificaciones al péptido residuos que se encuentran fuera del motivo de unión a TCR puede tener impredecibles efectos en cadena sobre los residuos peptídicos adyacentes que abroga la unión del TCR y el reconocimiento de las células T. Nuestros resultados representan el primer ejemplo de los mecanismos estructurales que subyacen en el reconocimiento de células T de esta importante diana terapéutica para el melanoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.O.C. media</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbi-Safe New Orbit incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Coomassie Stain SafeStain&#160;</td>
			<td>Generon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend RT centrifuge&#160;</td>
			<td>Sorvall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Arcos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonopuls HD 2070&#160;</td>
			<td>Bandelin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND1000&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides</td>
			<td>Peptide Protein Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine&#160;</td>
			<td>SAFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cystamine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metricel 0.45 &#956;m membrane filter</td>
			<td>Pall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POROS 10/100 HQ&#160;</td>
			<td>Applied biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure FPLC system&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline&#160;</td>
			<td>Oxoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAcore buffer HBS&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation kit</td>
			<td>Avidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAcore T200</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 chip coupling kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcal VP-ITC&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon crystallisation robot</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-plate&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallisation screens and reagents</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flask&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filters</td>
			<td>Miller-GP, Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear ultracentrifuge tube&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP with SW28 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3/CD28 Dynabeads&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK medium, PHA</td>
			<td>Alere Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRV&#946; mAb&#160;</td>
			<td>BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dasatinib&#160;</td>
			<td>Axon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-1&#946; and TNF&#945; ELISA&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;51Cr&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1450 Microbeta counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
		</tr>
	</tbody>
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using x-ray crystallography, biophysics, and functional assays to determine the mechanisms governing t-cell receptor recognition of cancer antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

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Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Investigación

Inmunología e Infección

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antígenos funcional protegido glóbulos rojos por la membrana injerto de compactos Poligliceroles hiperramificados

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...