Name: using x-ray crystallography, biophysics, and functional assays to determine the mechanisms governing t-cell receptor recognition of cancer antigens
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens at JoVE.co

BM stöds av en cancerforskning UK doktorand. AG stöds av ett Life Science Research Network Wales doktorand. VB stöds av en Cancer Research Wales doktorand. DKC är en Wellcome Trust Research karriärutvecklings Fellow (WT095767). AKS är en Wellcome Trust Investigator. GHM finansieras av en gemensam Life Science Research Network Wales och Tenovus Cancer Care doktorand. Vi tackar personalen på Diamond Light Source för tillhandahållande av anläggningar och stöd.

1. Protein Expression <ol><li> Göra genkonstruktioner för generering av lösliga TCR och pHLAs, såsom beskrivs i detalj tidigare 17, 18. Utforma varje konstrukt med en 5 &#39;BamH1 och en 3&#39; EcoR1 restriktionsställe för insättning i pGMT7-vektor. </li><li> Transformera E. coli Rosetta (DE3) pLysS med en pGMT7-härledd plasmid vektor som innehåller den sekvens som kodar för proteinet av intresse genom att inkubera en mikroliter av 50 till 200 ng / | il plasmid med 5 mikroliter av E. coli under 5 minuter vid 4 ° C , 2 min vid 42 ° C och 5 min vid 4 ° C, och plattan ut över natten vid 37 ° C på en LB-agarplatta som kompletterats med 50 mg / L carbenicillin. </li><li> Plocka individuella kolonier och växa vid 37 ° C och 220 rpm i 30 ml TYP-media (16 g / L trypton, 16 g / L jästextrakt, och 5 g / L HK 2 O 4) kompletterat med 100 | iM karbenicillin tills suspensionen når en optisk density (OD 600) av mellan 0,4 och 0,6. </li><li> Inducera proteinproduktion i en 5 ml alikvot genom att införa 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) under 3 timmar. Hålla 20 mikroliter av suspensionen med och utan induktion för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) analys och fläcka gelén. </li><li> Lägg startkulturer till en L av TYP kompletterat med 100 ^ M karbenicillin och växa celler såsom beskrivits ovan i steg 1,3 tills suspensionen når ett OD 600 mellan 0,4 och 0,6. </li><li> Inducera proteinexpression under 3 h med 0,5 mM IPTG. Centrifugera cellerna under 20 min vid 3000 x g och häll bort supernatanten försiktigt. </li><li> Upplösa pelleten i 40 ml lyseringsbuffert (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM magnesiumklorid, MgCl2; 150 mM NaCl; och 10% glycerol), Sonikera på is under 30 min vid 60% effekt under användning av en 2 s intervall och inkubera vid rumstemperatur (RT) under 30 min med 0,1 g / L DNas. </li><li> Behandla suspensionen innehållande proteinerna i form av inklusionskroppar (IB) med 100 ml tvättbuffert (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; och 10 mM EDTA). </li><li> Centrifugera provet under 20 min vid 4 ° C och 8000 x g och häll bort supernatanten försiktigt. Återsuspendera pelleten i 100 ml återsuspensionsbuffert (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; och 10 mM EDTA, pH 8,1), centrifugera som förut vid 8000 xg, och häll bort supernatanten försiktigt. </li><li> Slutligen upplösa pelleten i 10 ml guanidinbuffert (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1; och 100 mM NaCl) och mäta proteinkoncentrationen vid 280 nm med användning av en spektrofotometer. </li></ol> 2. pHLA och TCR Återveckning <ol><li> För pHLA refolds, blanda 30 mg av HLA-A2 (eller HLA-A2 med en biotin tag) IB, 30 mg p2m IB, och 4 mg peptid under 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad i en slutlig volym av 6 ml guanidinbuffert kompletterat med 10 mM ditiotreitol(DTT). </li><li> Initiera proteinåterveckning genom att späda den föregående blandningen i 1 L av en pre-kyld HLA återveckning-buffert (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-arginin; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, och 4 mM cystamin). </li><li> Lämnar HLA refold omröring vid 4 ° C under 3 h och sedan överföra den till en kDa MWCO 12,4 (molekylviktsgräns) dialysrör och dialysera två gånger under 24 h mot 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> För TCR refolds, blanda 30 mg av TCR α-kedjan IBS och 30 mg TCR β-kedjan IB i 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad i 6 ml guanidin buffert kompletterad med 10 mM DTT. </li><li> Initiera proteinåterveckning genom att späda den denaturerade TCR-blandningen i ett L av en pre-kyld TCR återveckning-buffert (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, och 4 mM cystamin) för tre h. </li><li> Överföra återveckning in i en 12,4-kDa MWCO dialysrör och dialysera två gånger under 24 h mot 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Filtrera både pHLA eller TCR refåringar som använder en 0,45-um membranfilter för reningsstegen. </li></ol> 3. Rening genom snabb protein vätskekromatografi (FPLC) <ol><li> Ladda den filtrerade återveckn beredningen (antingen pHLA eller TCR) på en 7,9 ml, um anjonbytarkolonn 50 förekvilibrerats med 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 på en flexibel och intuitiv kromatografisystem. </li><li> Eluera proteinet vid 5 ml / min med en saltgradient (0-500 mM NaCl i 10 mM Tris, pH 8,1, över 8 kolonnvolymer) och samla en-ml fraktioner. </li><li> Analysera fraktioner motsvarande proteinet av intresse med hjälp av SDS-PAGE, pool de fraktioner som innehåller proteinet av intresse tillsammans, och koncentrera dem ner till 500 mikroliter med 10-kDa MWCO 20 eller 10 kDa MWCO 4 genom centrifugering under 20 min vid 4000 xg och kasta genomströmning. </li><li> Ladda de koncentrerade proteinberedningar i en 2 ml injektionsslinga på en 24 ml storleksuteslutande kromatografi-kolonn som förekvilibrerats med appenropriate elueringsbuffert: fosfatbuffrad saltlösning (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA; och 0,005% ytaktivt medel), eller kristall-buffert (10 mM Tris, pH 8,1, och 10 mM NaCl ). </li><li> Eluera proteiner vid en flödeshastighet på 0,5 ml / min under en kolonnvolym; samla in 1 ml fraktioner innehållande proteinet av intresse verifieras genom SDS-PAGE. OBS! Dessa metoder användes för att generera lösliga Pmel 17 TCR och gp100 TCR, liksom alla de pHLAs användes i denna studie: HLA-A * 0201 med YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), eller YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Surface Plasmon Resonance (SPR) Analys <ol><li> Utför jämviktsbindande analys eller termodynamisk analys med hjälp av en molekylär interaktion analyssystem utrustat med en CM5-sensorchip 19. </li><li> Aktivera CM5-chip av fjande en 1: 1 blandning av 100 mM N-hydroxisuccinimid (NHS) och 400 mM 1-etyl-3- (3-dimetylpropyl) -carboiimide (EDC) under 10 min vid en flödeshastighet av 10 | il / min och vid 25 ° C. </li><li> Belastning ca 5000 responsenheter (RU) av streptavidin (110 | il av 200 | ig / ml i 10 mM acetat, pH 4,5) genom kovalent länkade till spånytan i alla fyra flödesceller och använda 100 | il av 1 M etanolamin-hydroklorid för att deaktivera eventuella kvarvarande reaktiva grupper. </li><li> Par cirka 500-600 RU i pHLA vid ~ 1 ^ M i kommersiell buffert (tillhandahålls av tillverkaren), till CM5 sensorchip i långsam flödeshastighet av 10 ml / min för att säkerställa jämn fördelning på chipytan. </li><li> Mätta spånytan med 1 mM biotin i kommersiell buffert (tillhandahålls av tillverkaren) i 60 s. </li><li> Injicera tio serieutspädningar av lösliga TCR över de relevanta flödesceller vid en hög flödeshastighet av 30 | il / min vid 25 ° C. </li><li> Beräkna jämvikts-bindningskonstanten(K D (E)) värden med en icke-linjär kurvanpassning (y = (P1X) / (P2 + x)) 20. OBS: y = svarsenheter, x = analytiker koncentration, P1 = r max, P2 = Kd. </li><li> Utför kinetik analys antar en 1: 1 Langmuir bindande och montera data med hjälp av en global passningsalgoritm i programpaketet 2. </li><li> Utföra termodynamik experiment genom att upprepa detta förfarande vid följande temperaturer: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, och 30 ° C 19. </li><li> Använd K D-värden bestämda av SPR vid olika temperaturer för att beräkna AG ° med hjälp av standardtermodynamiska ekvationen (AG ° = -RTlnK D) 19. OBS: R = gaskonstanten, T = temperaturen i K, ln = naturliga logaritmen. </li><li> Beräkna termodynamiska parametrar enligt Gibbs-Helmholtz ekvation (AG ° = AH - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Plotta de bindande fria energier, AG ° (AG ° = -RTlnK D), mot temperatur (K) med användning av en icke-linjär regression för att passa tre-parameterekvation (y = AH + ACp * (x-298) -x * ΔS- x * ACp * ln (x / 298)) 19. OBS: y = temperaturen i K, x = AG °. </li></ol> 5. Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC) <ol><li> Utför ITC experiment med användning av en isotermisk titrering kalori. Injicera 30 ^ M pHLA i kalori cellen och lasten 210 iM löslig TCR i sprutan. Använd följande buffertbetingelser: 20 mM HEPES (pH 7,4) innehållande 150 mM NaCl. </li><li> Utför 20 TCR injektioner, var och en av en 2 mikroliter volym. Beräkna AH och K D medelst analytisk mjukvara. </li></ol> 6. Kristallisering, diffraktion datainsamling, och modell Förädling <ol><li> Utför kristallisering prövningar med hjälp av en kristallisationsrobot. </li><li> Växa kristaller av VAPeller diffusion vid 18 ° C via sittande droppe teknik i en 96-brunnsplatta med en reservoar innehållande 60 mikroliter av kristallisationsbuffert (moderlut) 21. </li><li> Koncentrera den lösliga pHLA till cirka 10 mg / ml (0,2 mM) i kristall buffert genom spinning vid 3000 x g i en 10-kDa molekylviktsgräns centrifugalkoncentrator. </li><li> För de samverkande komplexa strukturer, blanda TCR och pHLA vid ett 1: 1 molärt förhållande för att erhålla en proteinlösning vid ungefär 10 mg / ml (0,1 mM). </li><li> Lägg 200 nL av pHLA ensam, eller 1: 1 molförhållande blandning av TCR och pHLA, till 200 nL av varje reservoarlösningen från kristallisationsskärmen med användning av en kristallisationsrobot och göra mål för kristaller under ett mikroskop efter 24 h, 48 h, 72 h, och sedan en gång i veckan. </li><li> Harvest enkristaller genom att manuellt montera dem i Cryo-slingor under ett mikroskop och Cryo-kyl dem genom att sänka ned och lagra dem i flytande kväve (100 K). OBS: Laddar kristaller tar lite PracTice, och beslutar vilka kristaller är tillräckligt bra för datainsamling kommer med erfarenhet. Som en tumregel, desto större och mer regelbunden kristallen, desto bättre. </li><li> Samla in data i en ström av kvävgas vid 100 K. OBS: Dessa data förvärvades i Diamond Light Source (DLS) nationell synkrotronljus vetenskap anläggning i Storbritannien. </li><li> Analysera data genom att uppskatta reflektionsintensitet med xia2 med både MOSFLM 22 och XDS paket 23, och sedan skala data med SCALA eller UTAN MÅL 24 och CCP4 paketet 25. </li><li> Lös strukturer med molekylär ersättning använder PHASER 26. </li><li> Justera modellen med Sothöna 27 och förfina modellen med REFMAC5 28. </li><li> Förbered grafiska representationer med PyMOL 29. </li><li> Beräkna kontakterna genom att använda &quot;kontakt&quot;program i CCP4-paketet. Använd en 4 en cut-off för van der Waals-kontakter och en 3,4 Å cut-off för vätebindningar och saltbryggor. </li><li> Beräkna yta komplementaritet med &quot;SC&quot; program i CCP4 paketet. </li><li> Beräkna korsningsvinkeln av TCR-pHLA komplex, som beskrivits 30. OBS: För denna studie var de reflektionsdata och slutliga modellkoordinater deponerats hos databasen PDB (Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, och A2 -YLE-5A PDB: 5EU5). </li></ol>

The authors have no conflicts of interest or competing financial interests.

Protokollen som beskrivs här ger en ram för molekylära och cellulära dissektion av T-cellsvar i samband med någon mänsklig sjukdom. Även cancer var i fokus för denna studie har vi använt mycket likartade metoder för att undersöka T-cellsvar mot virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 och under autoimmunitet 38, 39, 40. Dessutom har vi använt dessa tekniker mer allmänt att förstå de molekylära principer som styr T-cellsantigenigenkänning 2, 19, 41, 42. Faktum är att det oförutsägbara ändringar peptidrester, även deutanför av TCR kontaktrester, har effekter T-celligenkänning viktiga implikationer för utformningen av heteroclitic peptider. Dessa upptäckter har direkt bidragit till utvecklingen av nya T-cellterapi, inklusive peptidvacciner 6, 43 och artificiella hög affinitet TCR 3, 4, 5, 20, 44, samt förbättrade diagnostik 45, 46, 47. Kritiska steg i protokollet Genereringen av en i hög grad ren, funktionellt protein är väsentlig för alla de metoder som beskrivs i detta dokument. Ändringar och felsökning Svårigheter att generera mycket rent protein ofta avser uttryck för starkt-Pure, olösligt IB från E. coli-expressionssystem. Vanligtvis modifiering av uttrycket protokoll (t.ex. inducera vid olika optiska tätheter, med olika E. coli-stammar, eller med hjälp av olika medier formationer) löser dessa frågor. Begränsningar av tekniken Dessa tekniker använder lösliga proteinmolekyler (TCR och pHLA) som normalt uttrycks på cellytan. Därför är det viktigt att se till att de strukturella / biofysiska resultat överensstämmer med cellulära metoder för att bekräfta biologisk betydelse. Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder Genom att använda röntgenkristallografi och biofysik underbyggda genom funktionell analys, har vi och andra har visat att TCR specifik för cancer epitoper i allmänhet kännetecknas av låga bindningsaffiniteter 48. Denna låga TCR affinitet kan hjälpa till att förklara varför T-celler are inte naturligt effektiv på att rensa cancer. Högupplösta atom strukturer av komplex mellan anti-cancer TCR och besläktade tumörantigener börjar att avslöja den molekylära grunden för denna svaga affinitet. Dessutom är dessa studier är användbara för att bestämma de mekanismer som ligger bakom de terapeutiska ingripanden som utformats för att lösa detta problem, sådd framtida förbättringar 16. I denna studie undersökte vi den första strukturen av en naturligt förekommande αβTCR i komplex med en gp100 HLA-A * 0201-begränsade melanom epitop. Strukturen i kombination med en fördjupad biofysikalisk undersökning visade den totala bindningsläget för interaktion. Vi avslöjade också en oväntad molekylbrytare, som inträffade i en muterad form av peptiden, som upphävde TCR bindning (bedömas med hjälp av ytplasmonresonans) och CD8 + T-celligenkänning (funktionella experiment). Det var endast möjligt att demonstrera den nya mekanismen för HLA-antigen presentatipå att använda de högupplösta beskrivna metoderna. Framtida tillämpningar eller riktningar efter att behärska denna teknik Sammantaget våra resultat visar kraften i röntgenkristallografi och biofysikaliska metoder i kombination med robusta funktionella analyser. Med användning av dessa metoder är det möjligt att dissekera ut exakta molekylära mekanismer som reglerar T-cellantigenigenkänning. I själva verket är det också möjligt att använda denna metod för att lösa strukturen av oligerat TCR, visar hur konformationsförändringar kan spela en roll under antigen diskriminering 49, 50, 51. En bättre förståelse av den mycket komplicerade och dynamiska karaktär som ligger till grund TCR-pHLA interaktioner har också uppenbara konsekvenser för terapi design. Att kunna direkt &quot;se&quot; de molekyler som håller på att terapeutiskt riktade, liksom effekten att modifikationer har på antigen recognition, helt klart kommer att förbättra utvecklingen av dessa läkemedel framöver. I denna studie visar vi att till och med förändringar i ett enda peptidrest som inte är kraftigt anlitas av en TCR oförutsägbart kan överföra strukturella ändringar av andra rester i HLA-bunden peptid, vilket i sin tur förändrar dramatiskt T-celligenkänning. En mer fullständig förståelse av de molekylära mekanismer som under T-cellsantigenigenkänning blir enormt fördelaktigt när man utformar framtida terapier för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar.

Röntgenkristallografi har varit, och kommer att fortsätta att vara en extremt kraftfull teknik för att förstå vilken typ av ligand-receptorinteraktioner. Genom att visualisera dessa interaktioner i atom detalj, är det inte bara möjligt att avslöja de molekylära mekanismer som styr många biologiska processer, men det är också möjligt att direkt ändra kontaktytor för terapeutisk fördel. Tillsammans med tekniker såsom ytplasmonresonans och isotermisk titrering kalorimetri (för att bara nämna ett par), kan sådana ändringar sedan analyseras biofysiskt att bedöma de direkta effekterna på bindningsaffinitet, interaktions kinetik och termodynamik. Slutligen, genom att utföra funktionella experiment på relevanta celltyper, en detaljerad bild av den molekylära och funktionella effekterna av ändringar receptor-ligandinteraktioner kan härledas, ger mycket specifik mekanistisk information. Sammantaget dessa typer av metoder ger en atomär upplösning bild som gör det möjligt avskräcka<html> ställandet av hur biologiska system fungerar, med åtföljande konsekvenser för diagnostiska och terapeutiska framsteg. Vårt laboratorium rutinmässigt använder dessa tekniker för att studera de receptorer som medierar human T-cell immunitet mot patogener och cancer, i autoimmunitet, och under transplantation. Här fokuserar vi på den mänskliga CD8 + T-cellssvar mot cancer, medierad av en interaktion mellan T-cellreceptorn (TCR) och HLA-antigen (HLA) -restricted tumör härledda peptider (pHLA). Detta är viktigt eftersom, även CD8 + T-celler kan rikta cancerceller, har vi och andra tidigare visat att anti-cancer TCR suboptimalt binda till deras besläktade pHLA 1, 2. Sålunda har många laboratorier försökt att förändra antingen TCR 3, 4, 5 eller peptidliganden 6,class = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8 för att öka immunogenicitet och bättre mål cancerceller. Men dessa metoder är inte alltid effektiva och kan ha allvarliga biverkningar, inklusive off-target toxicitet 4, 9, 10. Ytterligare forskning undersöker de molekylära mekanismer som styr T-celligenkänning av cancerantigener kommer att vara avgörande för att övervinna dessa brister. I den aktuella studien har vi fokuserat på svaren mot autologa melanomceller av CD8 + T-celler specifika för ett fragment av differentiering melanocytantalet antigen glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, presenteras av HLA-A * 0201 (den vanligaste -expressed humant pHLA klass I). Detta antigen har varit en allmänt studerade mål för melanom immunoterapi och har utvecklats som ett så kallat &quot;heteroclitic&quot; peptid i vilken en valin ersätter alaninankar position 9 för att förbättra pHLA stabilitet 11. Detta tillvägagångssätt användes för att öka induktionen av melanom-reaktiva CTL in vitro och har med framgång använts i kliniska prövningar 12. Däremot kan ändringar av peptidrester har oförutsägbara effekter på T-cellspecificitet, framgår av den dåliga effekten av de flesta heterolitic peptider på kliniken 6, 13. I själva verket, en annan heteroclitic form av gp100 280-288, i vilken peptidrest Glu3 ersattes Ala upphävde erkännande av en polyklonal population av gp100 280-288-specifika T-celler 14, 15. Vi har tidigare visat att även små förändringar i peptidförankringsrester väsentligt kan ändra T-celligenkänning på oförutsägbara sätt 6, 16. Således fokuserade studien på building en mer detaljerad bild av hur CD8 + T-celler känner igen gp100 och hur ändringar av samspelet mellan TCR och pHLA kan påverka den här funktionen. Här, vi genererat mycket rena, lösliga former av två TCR specifika för gp100 280-288 presenteras av HLA-A * 0201 (A2-YLE), samt naturliga och förändrade former av pHLA. Dessa reagens användes för att generera proteinkristaller för att lösa den ternära atomära strukturen av en human TCR i komplex med heteroclitic form av A2-YLE, liksom två av de mutanta pHLAs i oligerat form. Vi använde sedan en peptid scanning metod för att påvisa effekten av peptid substitutioner på TCR genom att utföra en fördjupad biofysiska experiment. Slutligen, vi genererade en genetiskt modifierad CD8 + T-cellinje, omprogrammerad för att uttrycka en av de A2-YLE specifika TCR, för att utföra funktionella experiment för att testa den biologiska effekten av de olika peptidmodifieringar. Dessa data visar att även moditioner att peptidrester som ligger utanför den TCR-bindande motivet kan ha oförutsägbara följdeffekter på intilliggande peptidrester som upphäver TCR-bindning och T-celligenkänning. Våra resultat representerar det första exemplet på de strukturella mekanismer som ligger bakom T-celligenkänning av detta viktiga terapeutiska mål för melanom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.O.C. media</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbi-Safe New Orbit incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Coomassie Stain SafeStain&#160;</td>
			<td>Generon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend RT centrifuge&#160;</td>
			<td>Sorvall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Arcos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonopuls HD 2070&#160;</td>
			<td>Bandelin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND1000&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides</td>
			<td>Peptide Protein Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine&#160;</td>
			<td>SAFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cystamine&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metricel 0.45 &#956;m membrane filter</td>
			<td>Pall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POROS 10/100 HQ&#160;</td>
			<td>Applied biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure FPLC system&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline&#160;</td>
			<td>Oxoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAcore buffer HBS&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation kit</td>
			<td>Avidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAcore T200</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 chip coupling kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcal VP-ITC&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon crystallisation robot</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-plate&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallisation screens and reagents</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flask&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filters</td>
			<td>Miller-GP, Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear ultracentrifuge tube&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP with SW28 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3/CD28 Dynabeads&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK medium, PHA</td>
			<td>Alere Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRV&#946; mAb&#160;</td>
			<td>BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dasatinib&#160;</td>
			<td>Axon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-1&#946; and TNF&#945; ELISA&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;51Cr&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1450 Microbeta counter</td>
			<td>PerkinElmer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using x-ray crystallography, biophysics, and functional assays to determine the mechanisms governing t-cell receptor recognition of cancer antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Watch this Scientific Journal Video about Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens at JoVE.co

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Möss med fördefinierade Receptor T cellspecifika Against Toxoplasma gondii Erhållits via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Masspektrometrisk analys av glykosfingolipid antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

De<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur och mönsterigenkänning receptorstimulering av Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...