Name: mouse model for pancreas transplantation using a modified cuff technique
Uploaded: 2017-12-16T13:00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios #2008-1-596 e #UNI-0404/1956 do "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/) e pela concessão #2013-042018 do "Förderungsprogramm de MUI-Start" da universidade médica Innsbruck.

A fim de evitar respostas alloimmune e estritamente investigar danos de enxerto relacionadas com lesão de reperfusão de isquemia, um syngeneic par doador-receptor deve ser usado. Neste protocolo, machos C57BL6 (H2b) 10-12-semanas ratos pesando 26 a 28 g foram usados como pares de doador-beneficiário de tamanho correspondente. Todos os animais foram alojados em uma instalação livre de patógeno de barreira e receberam atendimento humano em conformidade com os "princípios de laboratório Animal cuidados" formulado pela sociedade nacional para a pesquisa médica e o "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório" preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pela National Institutes of Health (NIH publicação n º 86-23, revista em 1985). Ministério da educação, ciência e cultura da Áustria aprovou os experimentos descritos neste manuscrito (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).
1. pâncreas Procurement
<ol>
	<li>Anestesia o animal dador com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de xilazina (5 mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) usando uma agulha (G) 27.</li>
	<li>Raspar o cabelo na região abdominal, usando um barbeador elétrico e consertar o mouse sobre o campo operatório em posição supina com fios de fita.</li>
	<li>Esfregue o campo operatório três vezes com gazes encharcada de clorexidina.</li>
	<li>Realize uma incisão abdominal com uma extensão de subcostal bilateral usando a tesoura. Delicadamente exteriorize as vísceras para a esquerda com varas de algodão estéril e embrulhe-as em uma gaze umedecida. Levante o xyphoid cranialmente com uma pinça mosquito para fornecer a máxima exposição da cavidade abdominal para as etapas seguintes.</li>
	<li>Usando uma agulha de 19g, injete 400 µ l de uma estéril, solução de cloreto de sódio-heparina 1:4 para heparinisation para a veia cava inferior (VCI). Depois de retirar a agulha, abater o animal por sangria cruza da aorta.</li>
	<li>Disse a aorta abdominal entre a origem da artéria mesentérica superior e a artéria renal direita separando delicadamente o tecido fibroso, usando pinça de ponta curva. Minar a aorta e amarrá-lo com uma ligadura de seda 8/0.</li>
	<li>Identifica o ligamento hepatoduodenal, que corre entre o pós-pilórico duodeno e o Hilo do fígado. Dividir o ducto biliar abaixo da entrada do ducto cístico após ligadura distal e suavemente dissecar e transecto a veia porta mais distalmente possível ter comprimento suficiente para realizar a anastomose do receptor.</li>
	<li>Usando pinças de ponta curvada, sem rodeios a dissecar a aorta abdominal a partir a ligadura anterior (consulte a etapa 1.6). Minar o tecido periaortic usando pinça de ponta curva, amarrá-lo com uma ligadura de seda 8/0 e transecto-lo com uma tesoura.<ol>
		<li>Usando a pinça bipolar, coagulam todos os seus ramos lombares e transecto a aorta com tesoura tão perto quanto possível para o diafragma, a fim de proporcionar suficiente comprimento para anastomose de vasos. Finalmente, transeção da aorta já amarrada acima da artéria renal esquerda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundir o pâncreas com uma seringa de 19 G com 5 mL de solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato 4 ° C em uma forma de hemorragias anterógradas através da aorta abdominal, até que haja um claro efluente proveniente da veia porta. Aplique pressão baixa para evitar a formação de edema. Nota: Para executar etapas 1.5 1.9 de forma rápida e padronizada, para evitar qualquer viés por deterioração isquêmica quente do enxerto recuperado.</li>
	<li>Substitua as vísceras na cavidade peritoneal, usando varas de algodão estéril.</li>
	<li>Usando pinças de ponta curvada, separe o pâncreas gradual a partir do duodeno pós-pilórico e avançar até atingir o ligamento de Treitz. Para estas etapas, identifica áreas de avascular do tecido conjuntivo entre o pâncreas e a parede duodenal.<ol>
		<li>Sem rodeios disse estas áreas usando pinça de ponta curva para isolar navios de pontes entre o pâncreas e o duodeno. Passar uma ligadura de seda 8/0 em torno de cada estrutura vascular isolada e amarrá-lo.</li>
		<li>Finalmente, transecto a estrutura vascular com tesoura em direção à parede duodenal. Da mesma forma, use uma sutura de seda 8/0 para separar o pâncreas, o estômago, o cólon transverso e o mesentério. Nota: Durante este procedimento, ducto pancreático-choledocho é ligado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifica o ligamento gastroesplênico correndo do baço para o estômago e os curtos Ramos gástricos, levantando o estômago cranialmente e cortá-lo com uma tesoura. Deixe o baço anexado ao enxerto recuperados. Nota: A fim de minimizar o reaquecimento do enxerto, irriga o pâncreas continuamente, utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 19g com a solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato frio armazenada no gelo.</li>
	<li>Finalmente, remova o pâncreas do local doador (figura 1B), agarrando o baço com fórceps e transferi-lo para o destinatário.<ol>
		<li>Como alternativa, para desencadear a lesão de reperfusão de isquemia severa, armazene o enxerto em estéril, solução de perfusão de 4 ° C durante 16 h antes de implantar isso no animal destinatário.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. destinatário preparação
<ol>
	<li>Anestesia o animal destinatário com uma injeção i.p. de xilazina (5 mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) usando uma agulha 27G.</li>
	<li>Raspar a região cervical lateral direita, usando um barbeador elétrico e coloque o mouse sobre o campo operatório em posição supina. Corrigi o mouse usando fios de fita. Evite a distensão excessiva dos membros dianteiros para evitar comprometer a respiração.</li>
	<li>Esfregue o campo operatório três vezes usando gazes encharcada de clorexidina.</li>
	<li>Fazer uma paramediana direita, incisão de pele ligeiramente oblíqua da jugular incisão para o ângulo da mandíbula direita.</li>
	<li>Sem rodeios, identificar e mobilizar os ramos laterais da veia jugular externa direita. Coagulá-los com pinça bipolar e transecto-los com uma tesoura.</li>
	<li>Levante o lobo direito da glândula salivar submandibular cranialmente, identificar o pedículo vascular e cauterizar usando pinça bipolar. Remova o lobo, cruza o pedículo cauterizado com uma tesoura.</li>
	<li>Em analogia ao passo 2.5, identificar todos os ramos medial da veia jugular externa, cauteriza-los com pinça bipolar e transecto-los com uma tesoura.</li></ol>Minar a veia jugular externa com a pinça de ponta curva como cranialmente quanto possível e ligam com ligaduras seda dois 8/0, deixando espaço suficiente entre as ligaduras.
	<li>Transecto a veia jugular externa entre as duas ligaduras previamente colocadas com uma tesoura reta.</li>
	<li>Passe a extremidade proximal da veia jugular externa através da braçadeira de polietileno (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo de 0,94 mm) e consertar o puxador do manguito com uma pinça de microhemostat venosa.</li>
	<li>Retire o laço na extremidade do coto navio e evert o navio sobre o manguito. Fixe a veia sempre no punho com uma circular 8/0 - seda ligadura (figura 1A).</li>
	<li>Proximal e distal cauterizar a parte superficial do músculo esternocleidomastoideo direito, transecto-lo com uma tesoura e removê-lo.</li>
	<li>Suavemente mobilize a artéria carótida comum, miná-lo abaixo da bifurcação e ligate duas vezes, tendo o cuidado de não amarrar a bifurcação carotídea. Corte o vaso entre os laços.</li>
	<li>Semelhante ao passo 2.9, passar a extremidade proximal da artéria carótida comum através da braçadeira de poliamida (diâmetro interno de 0,57 mm, diâmetro externo de 0.6 mm) e corrigi-lo com uma pinça arterial microvascular.</li>
	<li>Remover a ligadura na extremidade do coto vascular e gentilmente ampliar o lúmen usando dilatadores de vaso. Evert o navio sobre a braçadeira de pulso arterial e corrigi-lo com uma ligadura de seda 8/0 (figura 1A).</li>

3. a implantação
<ol>
	<li>Lugar o enxerto na região de pescoço do destinatário usando o baço como uma alça, com a cabeça voltada para lateralmente, a cauda incluindo o baço medialmente e os navio tocos ventro-caudalmente. Varas de algodão de uso para posicionar o enxerto corretamente.</li>
	<li>Encoste suavemente a veia porta do enxerto pancreático veia jugular externa do animal destinatário, o qual tem sido anteriormente revirada, e fixa-se na braçadeira apropriada (consulte a etapa 2.10). Corrigi-lo com uma ligadura de seda circular 8/0.</li>
	<li>Encoste o coto da aorta abdominal do enxerto para a artéria carótida comum sempre do destinatário animal. Corrigi-lo com uma ligadura de seda 8/0 e circunferencial (Figura 1).</li>
	<li>Identificar os vasos esplênico perto do hilo do baço e enfraquecê-los com pinça de ponta curva. Amarre-os com ligaduras seda 8/0 e transecto os vasos esplênico para remover o baço. Finalmente, encurte os laços.</li>
	<li>Usando uma pinça aplicando fórceps, remova a braçadeira a braçadeira venosa primeiro. Em seguida, retire a pinça arterial. Nota: Se o transplante foi um sucesso, o enxerto pancreático vai ser perfundido imediatamente, mostrando uma cor rosada homogénea e pulsação arterial visível (Figura 1).</li>
	<li>Umedeça o enxerto com solução salina normotérmico.</li>
	<li>Retire o cabo da braçadeira venosa utilizando pinça reta.</li>
	<li>Feche a ferida cirúrgica com uma execução sutura 6/0.</li>
</ol>
4. pós-operatório cuidados (Endpoint)
<ol>
	<li>Após o procedimento, aplicam-se a 0,5 mL de solução salina por via subcutânea (s.c.) para substituição da perda de líquidos no intra-operatório utilizando uma agulha de 19g.</li>
	<li>Manter o animal destinatário em uma almofada de aquecimento até a completa recuperação da anestesia.</li>
	<li>Uma vez acordada, retornar o destinatário animal para a instalação de habitação, onde pode ter comida e água ad libitum.</li>
	<li>Para evitar a dor pós-operatória, administrar logo após a operação (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg de peso corporal) cada 12 h para os 5 primeiros dias e carprofeno (2) 4 mg/kg de peso corporal cada 12 h s.c. na primeira semana.</li>
	<li>A fim de avaliar a ingestão nutricional adequada, monitorar o peso (g) de cada destinatário animal todos os dias. Uma perda de peso de mais de 10-15% em relação ao peso no dia da cirurgia, apatia, incapacitante, uma muito curvado para trás, bem como infecções cirúrgicas lado representam pontos de extremidade.<ol>
		<li>Neste caso, bem como depois de atingir o ponto de extremidade clínico, sacrifica o animal usando terminal isoflurano inalação.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gruessner, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2011+update+on+pancreas+transplantation:+comprehensive+trend+analysis+of+25,000+cases+followed+up+over+the+course+of+twenty-four+years+at+the+International+Pancreas+Transplant+Registry+(IPTR).">2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR).</a> Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).</li><li>Troppmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+after+pancreas+transplantation.">Complications after pancreas transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).</li><li>Fern&#225;ndez-Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+and+graft+pancreatitis+following+combined+pancreas-renal+transplantation.">Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation.</a> Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).</li><li>Eltzschig, H. 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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

IRI-associada a enxerto dano é inerente à transplantação de órgãos sólidos, e é caracterizada por um distúrbio da microcirculação. Acumulação de vários metabólitos fase isquêmica, e iniciação de cascatas inflamatórias mediada principalmente por espécies reactivas do oxigênio e nitrogênio, resulta em danos nos tecidos durante de reperfusão do enxerto4. Esta cascata pode comprometer o sucesso não só a curto prazo, mas também a longo prazo e, portanto, significativamente influências de sobrevivência de pacientes14. Até à data, o transplante de pâncreas rim combinado representa a terapia de escolha para pacientes que sofrem de tipo 1 diabetes com final de doença renal de estágio15. Vários estudos têm mostrado que um transplante de pâncreas rim combinado bem sucedida não apenas restaurar e proteger a função do enxerto renal em pacientes diabéticos, mas também estabiliza ou mesmo reverte as complicações secundárias, incluindo a neuropatia, bem como micro e macroangiopatia16,17,18.
Apesar de esforços contínuos em substituição, redução e refinamento (3 R) em pesquisas com animais, a reprodução de complexos processos fisiopatológicos, como IRI é meramente impossível nas configurações em vitro . Portanto, os modelos animais ainda são considerados para ser a ferramenta ideal para investigação de translação19,20. Modelos de mouse, como o descrito aqui tem várias vantagens em comparação com o rato ou outro animal modelos. Estes incluem a disponibilidade de uma vasta quantidade de cepas de rato puras geneticamente bem definida (por exemplo, cepas transgênicas e knock-out), uma infinidade de ferramentas de análise molecular, bem como um fácil e barato tratamento21. Uma grande vantagem do modelo descrito encontra-se na técnica não-sutura do manguito. Usando a técnica aqui apresentada, as taxas de sucesso de &#62; 90% são realizáveis, que é dramaticamente melhor em relação ao anteriormente descrito modelos22. Usando esta técnica de sutura não, reduzimos significativamente comuns complicações como choque hipovolêmico, trombose e estenose das anastomoses12. Uma vantagem adicional desse método consiste em posição abdominal extra do enxerto, que é associado com a rápida recuperação pós-operatória do destinatário. Além disso, a localização cervical torna perfeitamente adequado para na vivo de análise, como a imagem ao vivo do enxerto por exterioration sem qualquer tensão22.
A principal desvantagem deste modelo é a oclusão do ducto pancreático, que não se assemelham a realidade clínica. Neste modelo, drenagem exócrina é gerida pela subordinação ducto pancreático-choledocho. A longo prazo, isso resulta em um marcado de fibrose e atrofia da glândula sem levando a pancreatite22do enxerto. Devido a esta deterioração do tecido exócrino, que observamos mais cedo, no dia 30, após o transplante, acreditamos que este modelo não é adequado para observação de prazo longo. Em contraste, a função endócrina inquebrantável faz gylcemic controles do destinatário uma ferramenta fácil para avaliação diária da função do enxerto13,23,24.
Estas características isso torna um modelo ideal para a análise de lesões de enxerto precoce associados com períodos longos de preservação ou com técnicas e soluções diferentes de preservação. Para alcançar os melhores resultados com este modelo, devem considerar-se várias etapas cruciais. O pâncreas em si é muito suscetível à manipulação. Portanto, suave manipulação usando varas de algodão durante a recuperação do órgão e durante o implante minimiza o trauma mecânico. Agarramento direto da glândula com a pinça deve ser evitado, desde que inevitavelmente resultaria em danos graves de enxerto. Pela mesma razão, o baço é recuperado juntamente com o pâncreas e é usado como um identificador. Isto também é estabelecido na prática clínica. Uma armadilha mais envolve perfusão fria, que é conseguida pela perfusão através da aorta tronco usando solução de perfusão de histidina-triptofano-cetoglutarato de 4 ° C. Por este meio, um aumento excessivo da glândula pode ser evitado pelo perfusing suavemente o enxerto. A solução de perfusão restante deve ser usada para umedecer o enxerto, a fim de manter a sua temperatura baixa durante a recuperação do órgão.
No que respeita à preparação destinatário uma dissecção cuidadosa da veia jugular externa, bem como a artéria carótida comum define a base para o revascularisation bem sucedida. Em particular, a completa exposição da veia, removendo não só todos os afluentes, mas também do tecido adiposo circundante, é necessário para evitar a compressão externa e estenose pelo restante de tecido adiposo. A seleção de diâmetros o manguito adequado é crucial. Um diâmetro interno de 0,57 mm para a braçadeira de pulso arterial e entre 0,75 e 0,8 mm para a braçadeira venosa, com base na experiência partilhada, para ratos com peso entre 25 a 28 g, é apropriado. Precisos, corte limpo das bordas das algemas é obrigatória para evitar rasgar o coto do navio. Dilatação dos vasos, especialmente das artérias, é conseguida melhor com o uso de dilatadores de vaso com dicas bem. Como regra geral, o navio deve ser capaz de ampliar para duas vezes o lúmen do manguito. Durante o processo de eversão do navio sobre e corrigi-lo na braçadeira, recomendamos estabilizar pinças vasculares, colocando-os sob uma aba de pele, como isso facilita esta etapa crucial.
Como já mencionado, a não-sutura do manguito-técnica representa um método fácil para anastomose vascular e pode ser realizada dentro de 5 min. No entanto, o posicionamento correto do enxerto na região do pescoço do destinatário é de extrema importância para revascularização correta. Por este meio, o posicionamento final correto do enxerto na região do pescoço deve ser prevista a fim de permitir uma anastomose segura, em linha reta e sem tensão de veia e artéria. Navios que são muito longos tem que ser evitada, pois isso pode levar à obstrução de saída devido a formação de dobras. Pela mesma razão, o manguito-identificador na anastomose venosa também deve ser removido após a reperfusão. Em casos de hemorragias localizadas do enxerto pancreático, hemostasia bem sucedida pode ser conseguida comprimindo suavemente o lado sangramento por 5 min, usando varas de algodão. Esta é a maneira apenas bem sucedida para gerenciar este tipo de complicação.Cauterização, embora altamente seletiva, resultou na perda do enxerto em quase todos os casos, devido à pancreatite necrótica.
Em resumo, nós desenvolvemos um método para transplante de pâncreas em ratos, usando uma técnica não-sutura do manguito, que é tecnicamente viável e hipoglossal e tem taxas de sucesso excelente. Dada a fibrose progredient do pâncreas devido a oclusão do duto, este modelo é adequado melhor para áreas de pesquisa focando danos precoce do enxerto. Este manuscrito destina-se a permitir que os investigadores estabelecer com segurança Este modelo em seus laboratórios.

Transplante de pâncreas-rim simultâneo (SPK) representa o atual padrão de atendimento para pacientes que sofrem de diabetes mellitus e final doença renal. Transplante bem sucedido resulta em independência de insulina a longo prazo associada com estabilização ou mesmo regressão de microangiopatia diabética e uma melhor qualidade de vida1. No entanto, em contraste com outros transplantes de órgãos sólidos comuns, como rim e transplante hepático, pancreáticos enxertos são mais suscetíveis à lesão de isquemia reperfusão (IRI). Incidência relatada de até 35% em risco não só de enxerto, mas mesmo paciente, sobrevivência2,3.
Estresse oxidativo, transtornos microcirculatory, aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias e moléculas de adesão resultando finalmente na ativação endotelial e a perda de sua integridade, todos foram atribuídos para esta lesão do enxerto alogênico não 4. até agora, os mecanismos moleculares exatos do IRI são em grande parte desconhecidos e pode variar de órgão para órgão.
Apesar dos grandes progressos utilizando modelos em vitro , o desenvolvimento de modelos animais é fundamental para aprofundar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nas alterações de IRI-associado do enxerto após transplante de pâncreas. Foram desenvolvidos vários modelos de transplante de pâncreas em roedores5,6, mas o único que é relatado em ratos7. O calcanhar de Aquiles esta altamente exigentes de procedimento microcirúrgico é a taxa de sobrevivência baixa de 46%. No entanto, modelos de rato representam o melhor modelo para a investigação relacionada com o transplante, desde a mais ampla variedade de ferramentas de análise molecular pode ser aplicada a eles. Com base na vasta experiência microcirúrgica em camundongos com transplantes de órgãos diferentes8,9,10, desenvolvemos uma técnica nova, altamente reprodutível para pâncreas heterotópica, cervical transplante em ratos com &#62; 90% taxa de sucesso usando uma técnica não-sutura do manguito. Com esta técnica, complicações relacionadas com anastomoses são reduzidas ao mínimo, e uma elevada taxa de sucesso pode ser alcançada em comparação com a sutura modelo11. Até agora, apenas um modelo do rato com taxas de sucesso semelhantes tem sido descrito por Liu et al.12. No entanto, não há nenhum estudo publicado utilizando este modelo até agora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="783">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Adventitia Scissors</td>
			<td style="width:205px;">S&#38;T</td>
			<td style="width:131px;">S-00102</td>
			<td style="width:169px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Dumont # 7 Forceps</td>
			<td style="width:205px;">FST</td>
			<td style="width:131px;">&#160;11271- 30</td>
			<td style="width:169px;">Curved Tip 0.17 x 0.1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Yasargil Clip Mini Permanent 7mm</td>
			<td style="width:205px;">Aesculap</td>
			<td style="width:131px;">FE720K</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Micro vessel clip</td>
			<td style="width:205px;">S&#38;T</td>
			<td style="width:131px;">B1 00396 V</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Vessel dilatator</td>
			<td style="width:205px;">S&#38;T</td>
			<td style="width:131px;">D-5a.2, 00125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Clip applier</td>
			<td style="width:205px;">S &#38; T</td>
			<td style="width:131px;">CAF-4 00072</td>
			<td style="width:169px;">for venous cuff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Clip applier</td>
			<td style="width:205px;">Aesculap</td>
			<td style="width:131px;">FE572K&#160;</td>
			<td style="width:169px;">for the arterial cuff</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:279px;">Polyethylene tube</td>
			<td>Portex Ltd</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:169px;">Inner diameter 0.75 mm for venous cuff</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:279px;">Polymide tubing</td>
			<td style="width:205px;">Vention Medical&#160;</td>
			<td style="width:131px;">141-0051</td>
			<td style="width:169px;">Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:279px;">Polymide tubing</td>
			<td>Vention Medical</td>
			<td style="width:131px;">141-0033</td>
			<td style="width:169px;">Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bipolar forceps</td>
			<td style="width:205px;">Micromed</td>
			<td>140-100-015</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">8/0 silk ligatures</td>
			<td style="width:205px;">Catgut GmbH, Merkuramed</td>
			<td style="width:131px;">17209008</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Custodiol HTK solution</td>
			<td style="width:205px;">Dr. Franz K&#246;hler Chemie</td>
			<td style="width:131px;">59997</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ketamin Graeub</td>
			<td>aniMedica GmbH</td>
			<td style="width:131px;">32554</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:279px;">Xylasol Graeub</td>
			<td>aniMedica GmbH</td>
			<td style="width:131px;">50855</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse model for pancreas transplantation using a modified cuff technique

Modelos de mouse tem várias vantagens em pesquisa de transplante, incluindo a manipulação fácil, uma variedade de cepas geneticamente bem definidas e a disponibilidade da mais ampla gama de sondas moleculares e reagentes para executar na vivo , bem como em Vitro estudos. Baseado em nossa experiência com vários modelos de transplante murino, desenvolvemos um modelo de transplante heterotópico pâncreas em ratos com a intenção de analisar os mecanismos subjacentes grave isquemia reperfusão associada a lesão precoce enxerto danos. Em contraste com anteriormente descritas técnicas usando técnicas de sutura, neste documento descrevemos um novo procedimento usando uma técnica não-sutura do manguito.
Nos últimos anos, realizamos mais de 300 transplantes de pâncreas em ratos com uma taxa de sucesso global de &gt; 90%, uma taxa de sucesso nunca descrito antes no transplante de pâncreas de rato. A espinha dorsal desta técnica de sutura não braçadeira para revascularização do enxerto consiste de duas etapas principais: (I) encostando o navio recebedor um manguito de polietileno-poliamida e corrigi-lo com uma ligadura circunferencial e (II) do navio dador, colocando sobre o revirado navio recebedor e corrigi-lo com uma segunda ligadura circunferencial. A continuidade resultante dos resultados em menos lesões trombogénico com perviedade alta camada endotelial e, finalmente, altas taxas de sucesso.
Neste modelo, anastomose arterial é conseguido puxando a aorta abdominal do enxerto doador sobre a artéria carótida comum sempre do destinatário animal. Drenagem venosa do enxerto é conseguida encostar a veia porta do enxerto da veia jugular externa sempre do destinatário. Este manuscrito fornece detalhes e etapas cruciais da recuperação do órgão e os procedimentos de implantação do órgão, que permitirão que os investigadores com habilidades microcirúrgicos realizar o transplante com sucesso em seus laboratórios.

Na última década, foram realizadas mais de 300 transplantes de pâncreas em ratos. Depois de estabelecer o protocolo, houve uma sobrevida global de &#62; 90%. Sangramento pós-operatório foi a principal causa de falha, seguida de trombose do enxerto com pancreatite subsequentes enxerto necrótico letal. Em ambos os casos, os pontos de extremidade foram alcançados em 24 h e os animais foram sacrificados. Não havia qualquer doenças neurológicas, sintomas como disfagia e infecções cirúrgicas lado nesta série.
Para investigar a função endócrina de enxertos transplantados e, portanto, validar a patência do modelo, a hiperglicemia foi induzida em ratos destinatários pelo pré-tratamento com uma única dose de estreptozotocina intraperitonealmente aplicada (312,5 mg/kg de peso corporal) 4 dias antes da cirurgia. Foram considerados os ratos hiperglicêmicos se os níveis de glicose no sangue foram &#62; 300 mg/dL. Figura 2A mostra os níveis de glicose do sangue dos diferentes grupos. Ratos recebendo enxertos sem um tempo de isquemia fria prolongada de 16 h chegaram a normogylcemia dentro de 24 h após o transplante e mantiveram neste estado metabólico durante o período de observação de todo. Em contraste, os animais não-transplantados permaneceram hiperglicêmicos. Uma vez que estávamos interessados no impacto dos danos de enxerto associada a lesão de reperfusão de isquemia na função endócrina, adicionamos um terceiro grupo onde os enxertos foram expostos 16 h prolongado tempo de isquemia fria (CIT) e 45 min de tempo de isquemia quente (WIT). Ratos recebendo esses enxertos não chegou normoglycemia e tinham que ser sacrificado após 48 h, devido ao desenvolvimento de pancreatite grave, que foi mostrado para ser letal nesta modelo13.
Este modelo é útil para vários projectos que visam investigar a isquemia reperfusão associada a lesão precoce enxerto danos. Investigações incluíam, entre outros, microscopia confocal fluorescência intravital para quantificação de descontroles microcirculatory realizado 2h após o transplante. Contraste de microvessels dos enxertos foi reforçada pela injeção de 0,3 mL de dextrano de isotiocianato de fluoresceína-marcado um 0,4% (MW 150 000) na veia do pênis. Figura 2B exibe um padrão regular de capilar de um pâncreas murino ingênuo e de um enxerto no pâncreas transplantado, que não foi exposto a CIT prolongada (Figura 2). Em contraste, a Figura 2D apresenta a distribuição da microcirculação como resultado expondo o enxerto pancreático para cit prolongada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig1.jpg"> 
Figura 1 : Fotos intra-operatória. (A) visão intra-operatória dos destinatários vasos preparados para anastomose. A veia jugular externa (1) foi revirada sobre a braçadeira de polietileno venosa e fixada com uma ligadura de seda circular 8/0. Em analogia, a artéria carótida comum (2) foi revirada e fixa sobre a braçadeira de poliamida arterial menor. Escala da barra 1 mm. (B) o enxerto pancreático ex situ. A veia porta (1) e o coto da aorta abdominal (2) necessário para a anastomose vascular. O baço (3) é obtido juntamente com o pâncreas e é usado como um identificador. O baço será removido antes de reperfusão do enxerto. Escala da barra de 1 cm. (C) visão intra-operatória das anastomoses. A veia porta (1) é puxada sobre a braçadeira da veia jugular externa sempre (2) e corrigida com uma gravata de seda circular 8/0. Da mesma forma, o coto aórtico da aorta abdominal (3) é puxado sobre a braçadeira de pulso da artéria carótida comum sempre (4). Escala barra 1 mm. (D) intra-operatória vista do enxerto pancreático perfundido após 5 min reperfusão: após a remoção da veia, seguida pela pinça arterial, um enxerto do pâncreas transplantado com sucesso exibe uma cor rosada homogénea. O baço foi removido antes de reperfusão (1: embarcação esplênica ligada). Escala da barra de 1 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig2.jpg"> 
Figura 2 : Função endócrina do enxerto pancreático e confocal na vivo microscopia de fluorescência. Figura 2A mostra um gráfico de linha com níveis de glicose de ratos transplantados sem CIT (n = 10, PTX sem o CIT, linha azul), ratos não-transplantados (n = 11, nenhum PTX, linha vermelha) e os ratos recebendo enxertos expostos a CIT prolongada (PTX + 16 h CIT, n = 10, linha verde). Todos os destinatários foram previamente processados hiperglicêmicos com 312,5 mg/kg b.w. estreptozotocina i.p. Enquanto todos os destinatários dos enxertos sem CIT foram capazes de sobreviver o período de observação inteiro (50 dias) com função endócrina intacta, ratos transplantados não permaneceram hiperglicêmicos ao longo do período de observação inteira. Ratos recebendo enxertos expostos às 16h CIT não recuperou da hiperglicemia e tinham que ser sacrificado 48 h após a cirurgia de transplante, devido à perda de peso de mais de 10-15%. Ratos para sobreviver o período inteiro de observação foram sacrificados no dia 50 seguindo uma última medição da glicemia. Microcirculação em enxertos transplantados foi avaliada por microscopia confocal de fluorescência intravital 2h após o transplante. Pâncreas ingênuo serviram como controles. Figura 2B mostra um padrão regular de capilar no pâncreas ingênuo. Uma malha regular capilar também é vista em enxertos transplantados não sujeitos a CIT prolongada (Figura 2). Em contraste, um colapso da microcirculação é observado em enxertos transplantados expostos a CIT prolongada (Figura 2D). Escala barra 100 µm. dados no gráfico são expressos como ± desvio-padrão. PTX: transplante de pâncreas; CIT: tempo de isquemia fria; sem o: sem <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Entre a transplantação de órgãos sólidos abdominal, enxertos pancreáticos são propensos a desenvolver danos de enxerto associada a lesão de reperfusão isquemia severa, levando eventualmente a perda precoce do enxerto. Este protocolo descreve um modelo de transplante de pâncreas murino utilizando uma técnica não-sutura do manguito, ideal para analisar estes danos deletérios, cedo.

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