Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol><li> De avond voor transformatie, plaat 293T cellen in 3-5x10 6 cellen / 6 cm weefsel cultureplate. Opmerking: Wij gebruiken 293T-cellen voor hun gemak van transfectie en efficacyas virus producerende cellen. Deze cellen zijn deficiënt in de verpakking van het virus, tenzij een helper plasmide wordt geïntroduceerd. </li><li> De eerste ochtend, voorzichtig verwijderen medium en te vervangen door 4 ml 293T-cellen med die 25 mM Chloroquine. Zet in de incubator gedurende 1 uur. L...

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Vier kritieke punten zullen verzekeren het succes van een goede viral voorraad: <ol><li> De 293T-producerende cellen moeten zijn erg gezond, wat betekent dat ze zijn gesplitst op een zeer regelmatig schema, werden nooit overwoekerd, en zijn vergulde bij de optimale dichtheid van 3.5-5 miljoen per 6 cm weefselkweek bord, zodat ze een dichtheid te bereiken van 80% van de plaat op de ochtend van de transfectie. </li><li> Toevoeging van chloroquine verbetert de transfectie-efficiëntie en de daaropvolgende virustiter, ongeveer 3...

Alle gebruikte reagentia in de transfectie moeten steriel gefiltreerd (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) en bleef steriel.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Ons laboratorium onderzoek naar menselijke myeloproliferatieve ziekten veroorzaakt door dergelijke oncogenen als Bcr-Abl of groeifactor receptor-afgeleide oncogenen (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.). We zijn in staat om het model en een mens-achtige ziekte te bestuderen in ons muismodel, door het transplanteren van beenmergcellen die eerder geïnfecteerd met een retrovirus uiting van de oncogen van belang. Replicatie-defecte retrovirus dat codeert voor een menselijk oncogen en een marker (GFP, RFP, antibiotica-resistentie-gen, enz.) wordt geproduceerd door een transiënte transfectie protocol met behulp van 293T-cellen, een menselijke nier epitheel cellijn getransformeerd door het adenovirus E1A genproduct. 293 cellen hebben de bijzondere eigenschap dat zeer transfectable door calciumfosfaat (Capo 4), met maximaal 50-80% transfectie-efficiëntie gemakkelijk haalbaar. Hier hebben we co-transfecteren 293 cellen met een retrovirale vector uiting van de oncogen van belang en een plasmide die de gag-pol-env verpakking functies, zoals de single-genoom verpakking kat of PCL, bouwt in dit geval de Ecopak plasmide uitdrukt. De initiële transfectie wordt verder verbeterd door het gebruik van chloroquine. Voorraden ecotropic virus, verzameld als cultuur supernatant 48 uur. post-transfectie, kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C en worden gebruikt voor infectie van cel-lijnen in het licht van transformatie en in vitro studies, of primaire cellen zoals beenmergcellen van de muis, die vervolgens kunnen voor transplantatie worden gebruikt in ons muismodel .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfectie van de hippocampus Neuronen

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Voorbijgaande expressie van eiwitten door Hydrodynamic Gene Levering in Muizen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...