Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol><li> Le soir, avant la transformation des cellules plaque, au 293T 3-5x10 6 cellules / tissus 6 cultureplate cm. Note: Nous utilisons des cellules 293T pour leur facilité de transfection et les cellules produisant le virus efficacyas. Ces cellules sont déficientes en emballage le virus moins un plasmide auxiliaire est introduite. </li><li> Le premier matin, retirer délicatement les moyennes et les remplacer avec 4 ml de cellules 293T med contenant 25 mM de chloroquine. Mettez dans un incubat...

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Quatre points essentiels seront d&#39;assurer la réussite d&#39;un bon stock viral: <ol><li> Les cellules 293T de production doivent être en très bonne santé, ce qui signifie qu&#39;ils ont été séparés sur un calendrier très régulière, n&#39;ont jamais été envahi, et sont étalées à la densité optimale de 3,5 à 5000000 pour 6 cm de plaque de culture tissulaire, afin qu&#39;ils atteignent une densité de 80% de la plaque sur le matin de la transfection. </li><li> L&#39;addition de chloroquine améliore l&#39;...

Tous les réactifs utilisés pour la transfection doit être stérilisée par filtration (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) et maintenu stérile.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Nos études de laboratoire humaine myéloprolifératifs induite par les oncogènes tels que Bcr-Abl ou facteur de croissance dérivé des récepteurs oncogènes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Nous sommes capables de modéliser et d&#39;étudier une maladie humaine, comme dans notre modèle de souris, par la transplantation de cellules de moelle osseuse préalablement infectés par un rétrovirus exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt. La réplication des rétrovirus défectifs codant pour une oncogène humain et un marqueur (GFP, RFP, gène de résistance aux antibiotiques, etc) est produit par un protocole de transfection transitoire en utilisant des cellules 293T, une lignée de cellules épithéliales rénales transformés par le produit du gène E1A d&#39;adénovirus. 293 cellules ont la propriété inhabituelle d&#39;être très transfectables par phosphate de calcium (Capo 4), avec un maximum à 50-80% d&#39;efficacité de transfection facilement réalisable. Ici, nous avons co-transfecter 293 cellules avec un vecteur rétroviral exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt et un plasmide qui exprime les fonctions de conditionnement gag-pol-env, tel que le génome unique emballage construit kat ou PCL, dans ce cas le EcoPak plasmide. La transfection initiale est encore améliorée par l&#39;utilisation de la chloroquine. Les stocks de virus de écotrope, recueillis dans le surnageant de culture de 48 heures. post-transfection, peuvent être conservés à -80 ° C et utilisés pour l&#39;infection de lignées cellulaires en vue de la transformation et des études in vitro, ou des cellules primaires tels que les cellules de la moelle osseuse de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour une transplantation dans notre modèle de souris .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Cette technique démontre d&#39;une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l&#39;induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.

Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfection de neurones de l&#39;hippocampe

Recherche

Biologie

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d&#39;insectes Cultured

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...