Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערב קודם, השינוי התאים צלחת 293T ב 3-5x10 6 תאים / 6 cultureplate רקמות ס&quot;מ. הערה: אנו משתמשים 293T תאים על מנת להקל שלהם transfection ותאי efficacyas וירוס לייצר. תאים אלו חסרים האריזה וירוס אלא עוזר פלסמיד הוא הציג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר הראש...

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

ארבע נקודות קריטיות יבטיח את ההצלחה של מניות ויראלי טוב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים לייצר 293T צריך להיות מאוד בריא, כלומר הם היו מפוצלים לפי לוח זמנים קבוע מאוד, מעולם לא היו מגודלים, והם מצופה בצפיפות של 3.5-5000000 מותאם לכל צלחת 6 ס&quot;מ תרבות רקמות, כד...

כל ריאגנטים בשימוש transfection חייב להיות סטרילי, מסוננים (CaCl 2, 2x בהרוורד, miliQ H 2 O) והמשיך סטרילית.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

מחקרים במעבדה שלנו מחלות myeloproliferative האדם הנגרמת על ידי אונקוגנים כגון Bcr-Abl או גורם הגדילה לקולטן הנגזרות אונקוגנים (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα וכו &#39;). אנו מסוגלים מודל מחקר מחלות אנושיות, כמו במודל העכבר שלנו, על ידי השתלת תאים במח העצם נגוע בעבר עם רטרווירוס ביטוי oncogene של עניין. שכפול-פגום רטרווירוס קידוד oncogene האדם סמן (GFP, RFP, גן עמידות לאנטיביוטיקה, וכו &#39;) מופק על ידי פרוטוקול transfection חולף באמצעות תאים 293T, קו אנושי כליות תא אפיתל ממיר את המוצר adenovirus גן E1A. 293 תאים יש את המאפיין יוצא דופן להיות transfectable מאוד על ידי סידן זרחתי (Capo 4), עם יעילות של עד 50-80% transfection להשגה בקלות. כאן, אנו שיתוף transfect 293 תאים עם וקטור retroviral ביטוי oncogene עניין פלסמיד המבטא את איסור הפרסום-pol-env פונקציות אריזה, כגון הגנום יחיד אריזה בונה קאט או PCL, במקרה זה EcoPak פלסמיד. Transfection הראשונית היא שיפור נוסף על ידי שימוש chloroquine. מניות של הנגיף ecotropic, שנאספו supernatant תרבות 48 שעות. פוסט transfection, ניתן לאחסן -80 ° C ו המשמש זיהום של קווי תאים לאור השינוי במבחנה, או תאים ראשוניים כגון עצם לתאי מוח העכבר, כי לאחר מכן ניתן להשתמש להשתלה במודל העכבר שלנו .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

ג&#39;ין ירייה transfection של נוירונים בהיפוקמפוס

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...