Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
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<ol><li> La sera prima trasformazione, le cellule piastra 293T a 3-5x10 6 cellule / 6 cultureplate tessuto cm. Nota: utilizzare le cellule 293T per la loro facilità di trasfezione delle cellule e del virus efficacyas produzione. Queste cellule sono carenti nella confezione il virus a meno che un aiutante plasmide è introdotto. </li><li> La prima mattina, rimuovere delicatamente medie e sostituirlo con 4 ml di cellule 293T med contenente 25 mM clorochina. Messo in incubatrice per 1 ora. <br ...

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	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Quattro punti critici assicurerà il successo di una buona scorta virale: <ol><li> Le cellule 293T di produzione devono essere molto sano, nel senso che sono stati divisi su un programma molto regolare, non erano mai troppo lunghi, e sono placcati alla densità ottimale di 3,5-5000000 per 6 piastra di coltura tissutale cm, in modo che raggiungano una densità del 80% del piatto la mattina della trasfezione. </li><li> L&#39;aggiunta di clorochina migliora l&#39;efficienza di trasfezione e titolo del virus successivi, circa 3 ...

Tutti i reagenti utilizzati per la trasfezione deve essere sterile, filtrata (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) e mantenuto sterile.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

I nostri studi di laboratorio malattie umane mieloproliferative indotta da oncogeni come Bcr-Abl o recettore del fattore di crescita derivato oncogeni (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, ecc.) Siamo in grado di modellare e studiare un essere umano-come la malattia nel nostro modello di topo, con il trapianto di cellule del midollo osseo precedentemente infettati con un retrovirus che esprime l&#39;oncogene di interesse. Replica difettoso retrovirus che codifica una oncogene umano e un indicatore (GFP, RFP, gene di resistenza agli antibiotici, ecc) è prodotto da un protocollo di trasfezione transiente utilizzando cellule 293T, un essere umano linea di cellule renali epiteliali trasformate dal prodotto adenovirus gene E1A. 293 cellule hanno la proprietà di essere altamente insolito transfectable da fosfato di calcio (CAPO 4), con fino al 50-80% di efficienza di trasfezione facilmente raggiungibile. Qui, abbiamo co-trasfezione 293 cellule con un vettore retrovirale che esprime l&#39;oncogene di interesse e un plasmide che esprime la gag-pol-env funzioni packaging, come ad esempio il singolo genoma imballaggio costruisce kat o PCL, in questo caso la Ecopack plasmide. La transfezione iniziale è ulteriormente migliorata con l&#39;uso di clorochina. Gli stock di virus ecotropic, raccolti come supernatante di coltura 48 ore. post-trasfezione, possono essere conservati a -80 ° C ed utilizzati per l&#39;infezione di linee cellulari in vista della trasformazione e studi in vitro, o cellule primarie come le cellule del midollo osseo di topo, che possono poi essere utilizzati per il trapianto nel nostro modello di topo .

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Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l&#39;induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

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