Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
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<ol><li>変換前の夕方、3 × 10 6セル/ 6 cmの組織cultureplateでプレート293T細胞。 注：私たちは、トランスフェクションとefficacyasウイルス産生細胞の容易さのために293T細胞を使用する。ヘルパープラスミドが導入されていない限り、これらの細胞は、ウイルスのパッケージングに不足しています。 </li><li>最初の朝、穏やかに培地を除去し、4ミリリットル293T細胞MEDは、25mMのクロロ?...

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	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

4つの重要な点は良いのウイ​​ルス株の成功が保証されます。 <ol><li> 293T産生細胞は、それらは非常に定期的に分割されている意味、非常に健康的である必要は草に覆われたことはなかった、と彼らは密度に到達するように、6 cmの組織培養プレートあたり3.5から5000000の最適化された密度でプレーティングされていますプレートの80％のトランスフェクションの朝に。 </li><li>セルlysozomesを安定化...

トランスフェクションに使用されるすべての試薬 ​​は、滅菌濾過になる（CaCl 2を 、2 × HBS、miliQ H 2 O）と無菌保管しなければなりません。

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Bcr - Ablタンパクまたは成長因子受容体由来の癌遺伝子（ZNF198 - FGFR1、BCR -PDGFRα、等）などのがん遺伝子により誘導される私たちの研究室の研究は人間の骨髄増殖性疾患。我々は以前に興味の癌遺伝子を発現するレトロウイルスを感染させた骨髄細胞を移植することにより、私たちのマウスモデルにおける人間のような疾患をモデル化し、勉強することができます。複製欠損レトロウイルスは、ヒトの癌遺伝子をコードするとマーカー（GFP、RFP、抗生物質耐性遺伝子など）は、293T細胞を用いた一過性トランスフェクションプロトコル、アデノウイルスE1A遺伝子産物で形質転換ヒト腎上皮細胞株によって産生される。 293細胞は容易に達成可能な最大50-80％のトランスフェクション効率と、リン酸カルシウム（CAPO 4）による高transfectableという異常な性質を持っている。ここで、我々はそのような単一ゲノムのパッケージングは​​、プラスミドEcoPakこのケースでは、KATまたはPCLを構築する。のようなギャグ- POL - env​​の包装の機能を、表現する関心の癌遺伝子の発現レトロウイルスベクターとプラスミドとの293細胞トランスフェクションのCO最初のトランスフェクションは、さらにクロロキンの使用により改善される。エコトロピックウイルスの株は、培養上清48時間として収集。トランスフェクション後、-80℃で保存し、変換の観点及びin vitro試験セルの行、またはそのようなし私たちのマウスモデルで移植に使用できるマウスの骨髄細胞などの初代培養細胞の感染に使用することができる。

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Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

この手法は、人間の癌遺伝子をコードし、その後マウスモデルにおける骨髄増殖性疾患の誘発に使用される。複製欠損レトロウイルス株を準備する効率的な方法を示します

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

海馬ニューロンの遺伝子郡のトランスフェクション

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

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半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

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Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

組換えRCAS(A)レトロウイルスのニワトリ胚水晶体へのマイクロインジェクション

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...