Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol><li> Вечером перед преобразованием, пластины 293T клетки в 3-5х10 6 кл / 6 см cultureplate ткани. Примечание: Мы используем клетки 293T за их простоту трансфекции и efficacyas вирусом клеток. Эти клетки являются несовершенными в упаковке вирус, если вспомогательную плазмиду вводят. </li><li> Перво?...

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Четыре критических точек будет гарантировать успех хорошего вирусного складе: <ol><li> 293T продуцирующие клетки должны быть очень здоровым, то есть они были разделены на очень регулярно, никогда не были заросшие, и высевают на оптимизированные плотностью 3,5-5 млн в 6 см планшета для культуры ткани...

Все реагенты, используемые в трансфекции должны быть стерильными фильтрами (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) и все стерильно.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Наша лаборатория изучает человеческое миелопролиферативных заболеваний, вызванных такими как онкогены Bcr-Abl или фактор роста рецептора полученных онкогенов (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα и т.д.). Мы можем моделировать и изучать человека-подобного заболевания у нашей модели мыши, путем пересадки клеток костного мозга ранее инфицированы ретровирусом выражения онкоген интересов. Репликация-дефектных ретровируса кодирования человеческих онкогенов и маркера (GFP, ППП, ген устойчивости к антибиотику, и т.д.) производится переходных протокол трансфекции с использованием 293T клеток человеческого эпителия почечных клеточной линии преобразуется продукт гена E1A аденовирусов. 293 клетки обладают необычным свойством высокой степени transfectable кальция фосфата (КАПО 4), до 50-80% эффективности трансфекции легко достижима. Здесь мы сотрудничаем трансфекции клеток 293 с ретровирусных вектор выражения онкоген интересов и плазмиды, что выражает кляп-пол-ENV упаковки функций, таких как одного генома упаковки строит кат или PCL, в данном случае EcoPak плазмиды. Начальная трансфекции является дальнейшее совершенствование использования хлорохину. Запасы ecotropic вируса, собранная, как культура супернатанта 48 часов. после трансфекции, можно хранить при температуре -80 ° С и использовали для заражения клеточных линий с учетом трансформации и в лабораторных исследованиях, или первичные клетки, такие как мышиные клетки костного мозга, которые затем могут быть использованы для трансплантации в нашей модели мыши .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Этот метод демонстрирует эффективный способ подготовки к репликации дефектной ретровирусных запасов кодирования человека онкоген, а в дальнейшем использоваться для индукции миелопролиферативные заболевания в мышиной модели.

Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Ген-пушечный Трансфекция нейронов гиппокампа

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Кратковременная экспрессия белков гидродинамическими доставки генов у мышей

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Масштабируемая трансфекция протопластов мезофилла кукурузы

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Микроинъекция рекомбинантного ретровируса RCAS(A) в хрусталик эмбриона курицы

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...