Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
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<ol><li> La noche antes de la transformación de células de placas, 293T en 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tejido cm. Nota: Usamos células 293T por su facilidad de transfección y virus productores de células efficacyas. Estas células son deficientes en el embalaje del virus a menos que un plásmido auxiliar que se introduce. </li><li> La primera mañana, retire suavemente medio y reemplazar con 4 ml de células 293T medicina que contiene 25 mM cloroquina. Puesto en la incubadora durante 1 ...

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	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Cuatro puntos críticos que aseguran el éxito de una acción viral buena: <ol><li> Las células 293T produce tiene que ser muy saludable, lo que significa que se han dividido en un horario muy regular, nunca fueron crecido, y se colocan en la densidad óptima de 3,5 a 5.000.000 por 6 cm de la placa de cultivo de tejidos, por lo que llegar a una densidad del 80% de la placa en la mañana de la transfección. </li><li> Además de la cloroquina mejora la eficiencia de transfección y el título de virus posterior, alrededor de...

Todos los reactivos utilizados en la transfección debe ser esterilizada por filtración (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) y se mantiene estéril.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Nuestros estudios de laboratorio de las enfermedades mieloproliferativas humanos inducida por oncogenes como Bcr-Abl o receptor del factor de crecimiento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR, etc.) Somos capaces de modelar y estudiar una enfermedad parecida a la humana en nuestro modelo de ratón, mediante el trasplante de células de médula ósea previamente infectadas con un retrovirus que expresan el oncogén de interés. Replicación defectuosa retrovirus que codifica para un oncogén humano y un marcador (GFP, RFP, gen de resistencia a antibióticos, etc) es producido por un protocolo de transfección transitoria con células 293T, un ser humano línea de células epiteliales renales transformado por el producto del gen E1A de adenovirus. 293 células tienen la extraña propiedad de ser altamente transfectable por fosfato de calcio (Capo 4), con hasta un 50-80% la eficiencia de transfección puede lograrse fácilmente. En este sentido, co-transfectar 293 células con un vector retroviral que expresan el oncogén de interés y un plásmido que expresa las funciones de embalaje gag-pol-env, como por ejemplo el genoma de un solo embalaje construye kat o PCL, en este caso el Ecopak plásmido. La transfección inicial se mejora aún más mediante el uso de la cloroquina. Las existencias de virus ecotropic, recogidos como sobrenadante de cultivo de 48 horas. después de la transfección, se pueden almacenar a -80 ° C y se utiliza para la infección de líneas celulares a la vista de la transformación y en estudios in vitro, las células primarias o como las células de médula ósea de ratón, que luego pueden ser utilizados para el trasplante en nuestro modelo de ratón .

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Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfección de las neuronas del hipocampo

Investigación

Biología

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Transfección escalable de protoplastos de mesófilo de maíz

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...