Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol><li> Kvällen innan förvandlingen, plåt 293T celler vid 3-5x10 6 celler / 6 cm vävnad cultureplate. Observera: Vi använder 293T celler för sin enkla transfektion och efficacyas virus celler. Dessa celler är brist på förpackningar viruset inte en hjälpare plasmid införs. </li><li> Den första morgonen, ta försiktigt bort medium och ersätt med 4 ml 293T cell med innehållande 25 mM klorokin. Sätt i inkubator för 1 tim. Observera: plattan bör vara ca 80% konfluenta....

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Fyra kritiska punkter kommer att försäkra framgång för en bra viral lager: <ol><li> Den 293T celler måste vara mycket frisk, vilket innebär att de har delats upp på ett mycket regelbundet schema, aldrig igen, och är klädd i den optimerade täthet av 3,5 till 5.000.000 per 6 cm vävnadsodling tallrik, så att de når en densitet 80% av plåten på morgonen den transfektion. </li><li> Tillägg av klorokin förbättrar transfektion effektivitet och efterföljande virus titer, ca 3 - till 5-faldig, genom att stabilisera...

Alla reagenser som används i transfektion måste vara steril-filtreras (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) och hålls sterila.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Vår laboratoriestudier mänskliga myeloproliferativa sjukdomar som orsakas av sådan onkogener som Bcr-Abl-eller tillväxtfaktor receptor-derived onkogener (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα etc.). Vi kan modellera och studera en mänsklig-liknande sjukdom i vår musmodell, genom att transplantera benmärgsceller tidigare infekterats med ett retrovirus som uttrycker onkogen av intresse. Replikering-defekt retrovirus kodar en människa onkogen och en markör (GFP, RFP, gen för antibiotikaresistens, etc.) är producerad av en transient transfektion protokoll med 293T celler, en mänsklig nedsatt epitelceller linje förvandlas genom adenovirus E1A genprodukten. 293 celler har den ovanliga egenskapen att vara mycket transfectable av kalciumfosfat (CAPO 4), med upp till 50-80% transfektion effektivitet lätt att uppnå. Här samarbete transfektera vi 293 celler med ett retrovirus vektor som uttrycker onkogen av intresse och en plasmid som uttrycker gag-pol-ENV förpackningar funktioner, såsom den enda-genomet förpackningar konstruktioner kat eller PCL, i detta fall Ecopak plasmiden. Den initiala transfektion förbättras ytterligare med hjälp av klorokin. Lagren av ecotropic virus, som samlats in som supernatant 48 timmar. efter transfektion, kan förvaras vid -80 ° C och används för infektion av cell-linjer på grund av omvandling och in vitro studier, eller primära celler såsom benmärg hos möss celler, som sedan kan användas för transplantation i vår musmodell .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Denna teknik visar ett effektivt sätt att förbereda replikering-defekta retrovirus lager kodar en människa onkogen, och därefter används för induktion av myeloproliferativ sjukdom i musmodell.

Produktion av replikationskompetenta Defekta Retrovirus av övergående transfektion av 293T celler

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfektion av hippocampus nervceller

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Optimerad Transfektion Strategi för Expression och elektrofysiologiska Inspelningen av rekombinanta spänningskänsliga jonkanaler i HEK-293T celler

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Produktion av Haploid Zebrafish embryon från<em&gt; In Vitro</em&gt; Befruktning

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Skalbar transfektion av majsmesofyllprotoplaster

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Mikroinjektion av rekombinant RCAS(A)-retrovirus i embryonal kycklinglins

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...