Name: production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

<ol><li> 3-5x10 6 hücre / 6 cm doku cultureplate dönüşümü, plaka 293T hücreleri önce akşam. Not: Biz transfeksiyon ve efficacyas virüs üreten hücrelerin kendi kolaylığı için 293T hücreleri kullanır. Bu hücreler, plazmid bir yardımcı tanıtıldı sürece virüs ambalaj eksikliği vardır . </li><li> Sabah ilk, orta hafifçe kaldırın ve 4 ml 293T hücre med 25 mM Klorokin içeren değiştirin. 1 saat için kuvöz koyun. Not: plaka konfluent yaklaşık%...

<ol>
	<li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system.">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells.">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li><li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kat:+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes.">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus.">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+chronic+myeloid+leukemia.">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li><li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL++leukemia+in+mice.">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li></ol>

Dört kritik noktaları iyi bir virüs stokunun başarısını temin edecektir: <ol><li> 293T üreten hücrelerin bir yoğunluk ulaşmak olduğunu, bu yüzden, çok düzenli olarak bölünmüş olan, yani çok sağlıklı olmak için büyümüş asla ve 6 cm doku kültürü plaka başına 3.5-5 milyon optimize yoğunlukta kaplama transfeksiyon sabahı plaka% 80. </li><li> Hücre lysozomes stabilize ve çekirdeği ulaşır DNA kesir artırarak, 5-kat klorokin eklenmesi yaklaşık 3 transfeksiyon verimliliği ve daha sonraki b...

Transfeksiyon kullanılan tüm reaktifler steril filtre edilir (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) ve steril tutulan gerekir.

production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293t cells

Bcr-Abl veya büyüme faktörü reseptör-kaynaklı onkogenler (ZNF198 FGFR1, Bcr-PDGFRα, vb) gibi onkogenler tarafından uyarılan laboratuar çalışmaları insan myeloproliferatif hastalıklar. Biz fare modelinde daha önce ilgi onkogen ifade bir retrovirüs ile enfekte kemik iliği hücrelerinin nakli, insan gibi bir hastalık modeli ve çalışma edebiliyoruz. Çoğaltma arızalı retrovirüs bir insan onkogen kodlama ve bir işaretleyici (GFP, RFP, antibiyotik direnç geni, vb.) 293T hücreleri, adenovirüs E1A gen ürünü tarafından dönüştürülmüş bir insan böbrek epitel hücre hattı kullanarak geçici bir transfeksiyon protokol tarafından üretilir. Kolayca ulaşılabilir% 50-80 transfeksiyon verimliliği kadar 293 hücreler, kalsiyum fosfat (Capo 4) yüksek transfectable olağandışı bir özelliği var . Burada, ilgi onkogen ve ambalaj Bu durumda kat veya PCL, yapıları tek genom EcoPak plazmid gibi gag-pol-env ambalaj fonksiyonları, ifade eden bir plazmid ifade retroviral vektör ile 293 hücreleri transfect ortak. Ilk transfeksiyon daha klorokin kullanımı artırıldı. Ecotropic virüs Hisse Senetleri, kültür süpernatant 48 saat olarak toplanır. post-transfeksiyon, C ° -80 saklanan ve dönüşüm görünümünde ve in vitro çalışmalardan sonra fare modeli nakli için kullanılabilir hücre hatları, ya da, fare kemik iliği hücreleri gibi birincil hücreleri, enfeksiyon için kullanılır. .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells at JoVE.com

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gen tabancası Transfeksiyon Hipokampal Nöronlar

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...