Name: nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

The NMR facilities were funded by the R&#233;gion Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

1. Produção de 15 N, 13 C-tau (Figura 1) <ol><li> Transformar pET15b-tau recombinante de T7 expressão plasmídeo 13,14 em BL21 (DE3) competente de Escherichia coli, células bacterianas 15. NOTA: o ADNc que codifica para o mais longo (441 resíduos de aminoácidos) isoforma da tau é clonado entre os locais de restrição Ncol e Xhol no plasmídeo pET15b. <ol><li> Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 7...

Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada de...

Um dos principais desafios da saúde no século 21 são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação 1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD. Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada 2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos 3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível 4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular. Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados ​​pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS 5. espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação 6 - 8. RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados 6 - 8. Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações 9. <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt; Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) 10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">pET15B recombinant T7 expression plasmid</td>
			<td style="width:177px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69257</td>
			<td style="width:196px;">Keep at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria</td>
			<td style="width:177px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C2527I</td>
			<td style="width:196px;">Keep at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Autoclaved LB Broth, Lennox&#160;</td>
			<td style="width:177px;">DIFCO</td>
			<td style="width:119px;">240210</td>
			<td style="width:196px;">Bacterial Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">MEM vitamin complements 100X</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">58970C</td>
			<td style="width:196px;">Bacterial Growth Medium Supplement</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">15N, 13C-ISOGRO complete medium powder</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">608297</td>
			<td style="width:196px;">Bacterial Growth Medium Supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:328px;">15NH4Cl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:196px;">Isotope</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:328px;">13C6-Glucose</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:196px;">Isotope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:328px;">Protease inhibitor tablets&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:177px;">Roche</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">5056489001</td>
			<td style="width:196px;">Keep at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:196px;">1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DNaseI</td>
			<td style="width:177px;">EUROMEDEX</td>
			<td style="width:119px;">1307</td>
			<td style="width:196px;">Keep at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Homogenizer (EmulsiFlex-C3)</td>
			<td style="width:177px;">AVESTIN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">Lysis is realized at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Pierce&#8482; Unstained Protein MW Marker</td>
			<td style="width:177px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">266109</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Active human MEK1 kinase, GST Tagged</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8822</td>
			<td style="width:196px;">Keep at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AKT&#196; Pure chromatography system</td>
			<td style="width:177px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">FPLC</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:328px;">HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column)</td>
			<td style="width:177px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-5156-01</td>
			<td style="width:196px;">Cation exchange chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:328px;">HiPrep 26/10 Desalting</td>
			<td style="width:177px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-5087-01</td>
			<td>Protein Desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:328px;">PD MidiTrap G-25</td>
			<td style="width:177px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9180-08</td>
			<td style="width:196px;">Protein Desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tris D11, 97% D</td>
			<td style="width:177px;">Cortecnet</td>
			<td>CD4035P5</td>
			<td style="width:196px;">Deuterated NMR buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner &#38; outerpipe)&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Euriso-top</td>
			<td style="width:119px;">BMS-005B</td>
			<td style="width:196px;">NMR Shigemi Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">eVol kit-electronic syringe starter kit</td>
			<td style="width:177px;">Cortecnet</td>
			<td style="width:119px;">2910000</td>
			<td style="width:196px;">Pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead</td>
			<td style="width:177px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">NMR spectrometer for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead</td>
			<td style="width:177px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">NMR spectrometer for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:328px;">TopSpin 3.1</td>
			<td style="width:177px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">Acquisition and Processing software for NMR experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:328px;">Sparky 3.114</td>
			<td style="width:177px;">UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:196px;">NMR data Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

A Figura 3A mostra um pico principal de absorção a 280 nm observados durante o gradiente de eluio. Este pico corresponde à proteína Tau purificada como visto no gel de acrilamida sobre o cromatograma. A Figura 3B mostra um pico de absorção bem separadas a 280 nm e o pico de condutividade, assegurando que a dessalinização da proteína é eficiente. A Figura 4 mostra a proteína de desvio em gel observada por análise de SDS-PAGE a 16 característica de fosforilação de pr...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Bioquímica

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Remoção e Substituição de Ligantes Endógenos de Proteínas e Alérgenos Lipid-Bound

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...