Name: testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio at JoVE.com

We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy &amp; Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

Ethik-Statement: Zebrabärbling-Embryonen erzeugt wurden nach einer genehmigten IACUC Protokoll. Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Georgetown University Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Organisieren Embryonen für Injection und erstellen Stammlösungen <ol><li> Generieren erforderlichen Zebrabärblingembryonen zur Krebszelle Gefäßinvasion beurteilen. <ol><li> Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1...

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	<li>Cummings, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+progression+of+breast+cancer:+insights+from+50+years+of+autopsies.">Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies.</a> Am J Path. 232, 23-31 (2014).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Reymond, N., d'&#193;gua, B. B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+endothelial+barrier+during+metastasis.">Crossing the endothelial barrier during metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+migration+in+three+dimensions.">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).</li><li>Rahim, S., &#220;ren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+electrical+impedance+based+technique+to+measure+invasion+of+endothelial+cell+monolayer+by+cancer+cells.">A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jeon, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling.">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).</li><li>Novoa, B., Figueras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+model+for+the+study+of+inflammation+and+the+innate+immune+response+to+infectious+diseases.">Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).</li><li>Kitamura, T., Qian, B. -. Z., Pollard, J. 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Diese Technik nutzt die Zebrabärbling Modell zur effizienten Steuerung des Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen (siehe Abbildung 1). Hier verwendeten wir die Technik zu einer Gruppe von Brustkrebszelllinien , um eine Basislinie zu schaffen , auf die andere Forscher können dann ihre eigenen Studien bauen (siehe Tabelle 1; Figuren 2 - 3). Die Beobachtung, dass MDA-MB-231-Zellen leicht in die Schwanzregion Genaktivität fallen würde diese Zelllinie idea...

Metastatische Erkrankung ist eine Hauptursache der Krebssterblichkeit und viele Mechanismen, die Krebszelle ermöglichen Verbreitung bleiben bis 1 entdeckt werden. Um für eine Krebszelle, um erfolgreich zu metastasieren, muss er zunächst durch das Stroma eindringen, die eine primäre Tumor umgibt, geben Sie (intravasate) in das Kreislaufsystem, überleben auf der Durchreise, Ausfahrt (extravasate) aus dem Kreislauf und schließlich eine tragfähige Kolonie gründen am entfernten Organstelle 2. Intravasation und Extravasation sind somit entscheidende Schritte in der metastatischen Kaskade, doch jeder Krebszelle ist nicht von Natur geschickt darin zu stören und die Migration durch endotheliale Kreuzungen 3. In der Tat gibt es eine Reihe von einzigartigen Selektionsdruck , die Krebszellen vaskuläre Invasion und der Prozess umgeben kann weiterhin durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Faktoren 4 beeinflusst werden. Aus diesen Gründen Techniken, die das aggressive Verhalten von fortgeschrittenen Stadium Krebs Sonde konzentrieren sich häufig auf vascular invasive Fähigkeit als Mittel Metastasierung zu prognostizieren. Verschiedene Modellsysteme existieren , um die Untersuchung von Krebszellen Gefäßinvasion in vitro zu erleichtern. Die am häufigsten verwendete in vitro Assays beinhalten entweder Transwell - Systemen Krebszellmigration durch eine endotheliale Schranke 5 oder Elektro Zell-Substrat - Impedance Sensing (ECIS) Technologie zur Überwachung des Echtzeit - Unterbrechung einer intakten endothelialen Monoschicht durch Krebszellen 6 zu bewerten. Diese Tests fehlt typischerweise die Fluiddynamik und Stroma-Faktoren, die sonst Krebszellbindung an eine Endothelwand auswirken würde. Dieses Problem wird etwas von perfundierbaren Gefäßnetze umgangen , die aus dem 3D - Kultur von Endothel entstehen mit Stromazellen zu unterstützen und diese 3D - Mikrofluidik - Systeme nun die Spitze der aktuellen In - vitro - Optionen 7,8 darstellen. Dennoch auslassen diese Ansätze die robuste Mikro eines funktionellen Kreislaufsystemund daher nur teilweise Ersatz für die in vivo - Modellen. Die am häufigsten in - vivo - Modell von Gefäßinvasion verwendet wird , ist die Maus, bei der experimentellen Metastasierung Assays häufig durchgeführt werden , weil sie auf relativ kurze Zeiträume und sind in der Regel bezeichnend für Metastasierungsfähigkeit 9 auftreten. Diese Tests umfassen die direkte Injektion von Krebszellen in den Verkehr und damit die Endstadien der Metastasierung zu modellieren, nämlich Extravasation und Krebszellbesiedelung von Organen. Die experimentellen Metastasierung Assays unterscheiden sich an der Stelle der Krebszellinjektion basiert und die Organe schließlich analysiert. Im ersten Assay - Typ, Krebszellen in die Schwanzvene von Mäusen und Krebszellaussaat in der Lunge injiziert werden , wird 10,11 überwacht. Der zweite Test beinhaltet die Durchführung intrakardiale Injektionen metastatic seeding in Richtung auf die Knochenmikro 12-14, sondern auch das Gehirn 15 zu lenken. In dem dritten Test, Krebs cells werden in die Milz injiziert , um Besiedlung der Leber 16 zu ermöglichen , während die vierte Lieferroute in die Arteria carotis Krebszellen zum Gehirn 17,18 trägt. Unabhängig von der Krebszelle Liefermethode, Organ Kolonisation ist die akzeptierte experimentellen Endpunkt und wird in der Regel über Lumineszenz, Histologie bestimmt, oder PCR-basierte Techniken. Trotz der physiologischen Vorteile von innerhalb eines murinen Wirt experimentellen Metastasierung Assays Durchführung dieser Experimente erfordern noch Wochen bis Monate abzuschließen und zu analysieren. Der Zebrafisch (Danio rerio) -Modell hat sich kürzlich als neuer Systemkrebsprogression 19,20, zu untersuchen und ermöglicht die Beurteilung von Krebszellen vaskuläre Invasion innerhalb eines Funktionskreislauf über einen viel kürzeren Zeitskala als bei Mäusen im Vergleich 21-24. Das Verfahren nutzt einen transparenten Zebrabärbling-Stamm, der seine Endothel mit einem grünen Riffkoralle Fluo markiertrescent Protein Reporter durch die kdrl Promotor, der Zebrabärbling Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 25 angetrieben. In dem Test werden die Krebszellen mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Embryonen injiziert. Irgendwo zwischen 48 bis 96 Stunden nach der Injektion von Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem und in die Schwanzvene Region von Embryonen eingedrungen sind effizient auf einem Fluoreszenzmikroskop erzielt. Hier wir die Technik zu einer Gruppe von üblicherweise verwendeten humanen Brustkrebszelllinien gelten für stark Unterschiede in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass für den Embryo yolk sac die Injektionsstelle zu ändern für die Untersuchung der heterogenen Zell-Interaktionen ermöglicht, als Krebszellpopulationen differentiell mit Fluoreszenzfarbstoffen und injiziert in Zebrabärbling-Embryonen fehlt Fluoreszenz Vaskulatur markiert werden. In diesem letzteren Test, Krebszellen, die das Eigelb eingedrungen sind und intravasated in die vasculature werden im kaudalen Bereich von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion erzielt. Aufgrund der Effektivität und Komfort dieses Modells sind Zebrabärbling zunehmend die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen unter einer physiologischen Umgebung, um schnell zu testen eingesetzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1253">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:491px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:316px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:321px;">25300-054</td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm Dishes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 3/4&#34; Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3160-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Molecular Grade</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4&#34;</td>
			<td>A-M Systems, Inc</td>
			<td>627000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td>
			<td>Hofstra Group</td>
			<td>3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode Storage Jar, 1.0MM</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash Brush</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Loading Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>02-707-181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Depression Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470005-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instant Ocean Salt, Sea Salt</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>IS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS20622B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E600</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-G Potassium</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP914-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Plates, 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>&#160;FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer II</td>
			<td>General Valve Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zebrafish&#160;</td>
			<td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Hier testeten wir die vaskuläre invasive Fähigkeit von häufig verwendeten Brustkrebszelllinien in einem Zebrafischembryo - Modell (Abbildung 1). Rigorose Kriterien wurden in Scoring-Extravasation für diese verschiedenen Zelllinien eingesetzt werden, wo positive Ereignisse nur dann, wenn die Krebszellen gezählt wurden deutlich extravasierten hatte, dieses Wesen hauptsächlich getan keine Falsch-Positiven zu begrenzen, die von Scoring Zelltrümmer entstehen könnten. ...

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Forschung

Krebsforschung

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Ein Time-Lapse, markierungsfreie, Quantitative Phase bildgebende Untersuchung der ruhenden und aktiven menschlichen Krebszellen

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Non-Invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma

Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Preclinical experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate human disease represent an important tool to study tumorigenesis and ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafischlarven als Modell zur Bewertung potenzieller Radiosensibilisatoren oder Protektoren

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...