Name: two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using gfp glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01-DK100584 og China State Key Laboratory av orale sykdommer Åpne Funding SKLOD2015OF01 (RB). Vi takker Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, og Kelly Lauter om hjelp.

Denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Massachusetts General Hospital. Oppsøk institusjonelle godkjenning for denne dyrestudie før du begynner. Noen teknikker kanskje må justeres i henhold til lokale IACUC krav. 1. GFP-PTX Mus <ol><li> Skaff PTHcre + mus og Rosa-mTmG mus på 8 - 10 uker gamle for videre parring. </li><li> Backcross de PTHcre + mus (blandet 129; FVB bakgrunn) med C57BL / 6 mus i 6 generasjoner for å få mus med C57BL / 6 bakgrunn. </li><li> Inbreed PTHcre + mus for å få PTHcre + / + mus 17. MERK: Hvis du vil utføre genotyping, trekke ut DNA fra tuppen av halen og bruke den for PCR. PCR-primere for å se etter heterozygositet og homozygosity av PTHcre transgenet er som følger: forover primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, revers primer A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse primer B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Cross PTHcre + / + mus 16 med Rosa-mTmG mus 18. Avvenne PTHcre; mTmG valper når 4 uker gammel. </li><li> Anesthetize 8 - 10 uker gamle PTHcre; mTmG mus ved ip injeksjon av tribromoethanol (Avertin) på 0,6 mg / g kroppsvekt, eller andre midler, for eksempel ketamin / xylazin. Bruk buprenorfin 0,1 mg / kg sc hver 12. time som et analgetikum i 48 timer etter operasjonen i henhold til en godkjent protokoll. Sikre passende dybde på anestesi ved tåen klype uttak refleks eller andre midler. Plasserer dyret i liggende stilling. </li><li> Utvid og forberede den ventrale nakkeregionen ved å barbere huden ved hjelp av enkle kantbladene. Desinfiser barbert hud med en povidonjodid antiseptisk pad. </li><li> Dekk dyret med sterile operasjonsduker for å redusere forurensning av det kirurgiske området og bruke autoklaveres microsurgical instrumenter for kirurgisk prosedyre. </li><li> Skjær en 2 cm langsgående snitt i huden med en kirurgisk skalpell. Dissekere fascia og presse spyttkjertlene til side ved stump disseksjon med buede taggete tang. </li><li> Under disseksjon mikroskop ved hjelp av halogen lys og en 4 - 5X forstørrelse, klipp og skille paratracheal musklene ved hjelp av skarpe tang tips og avsløre luftrøret. </li><li> Identifiser skjoldbruskkjertelen med høyre og venstre lapp som ligger ved siden av luftrøret. </li><li> Slå lyskilden til fluorescerende lys og visualisere de to grønne-fluorescerende biskjoldkjertlene. MERK: Vanligvis er de to biskjoldkjertlene plassert på eller nær overflaten av skjoldbruskkjertelen, men av og til, de befinner seg lenger unna. </li><li> Fjern forsiktig den grønne biskjoldkjertlene bruker kirurgisk pinsett og saks. Bruk steril kompress for hemostase og nøye kontrollere langs luftrøret for å sikre at alt grønt vev er fjernet. </li&gt; <li> Lukk paratracheal musklene ved avbrutt sutur hjelp 6-0 polyglaktin 910 sting. Lukk huden innsnitt ved Halsted sutur hjelp 6-0 polyglaktin 910 sting. </li><li> Valgfritt: Injiser 10 pl / g kroppsvekt steril normal 0,9% natriumkloridoppløsning til musene for væskeerstatning. </li><li> Plassere postsurgical dyr til et separat bur på en varm inkubator (37 ° C) i kroppstemperatur utvinning. Når musene er våken og i liggende stilling, sette pellet chow og vann med litt gelatin mat på buret gulvet. </li><li> Etter en postsurgical observasjonsperiode på 2 h, tilbake musen til dyret anlegget og følge lokale krav for postsurgical omsorg. </li><li> 3 dager etter paratyreoidektomi, få 10 mL halen blod og måle blod ionisert Ca ++ bruker en analysator som blodgass-systemet Ca ++ / pH analysator. Vellykket paratyreoidektomi resultater i blodet ionisert Ca ++ lik eller lavere enn -2SD av humbug-opererte controll mus (1,20 mmol / L i våre eksperimenter av n = 30). </li></ol> 2. PTH-Cre-IDTR Mus <ol><li> Skaff PTHcre + og DTR fl / fl mus på 8 - 10 uker gammel for parring. </li><li> Backcross de PTHcre mus (blandet 129; FVB bakgrunn) med C57BL / 6 mus i 6 generasjoner for å få mus med C57BL / 6 bakgrunn. </li><li> Inbreed den PTHcre + (C57BL / 6 bakgrunnen) mus for å få PTHcre + / + mus 17. MERK: For å utføre genotyping, DNA fra mus hale tips ble trukket ut og brukes til PCR. Genotyping Grunning: forover primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, omvendt primer A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forover primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse primer B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Mate PTHcre + / + mus 16 med DTR fl / fl mus 19 for å få PTHcre-IDTR mus. </li><li> Forbered DT løsning ved å fortynne diphtheriet toksin pulver med steril saltoppløsning til en konsentrasjon på 0,5 ug / ml. Steril filter, og lagre alikvoter ved -80 ° C. </li><li> Velg 8 - 10 uker gamle PTHcre-IDTR mus for injeksjon eksperiment. Tine DT alikvot til romtemperatur, administrere DT intraperitonealt i 5 ug / kg (10 pl / g) kroppsvekt av dyret. For maksimal effektivitet og minst toksisitet, blir DT administrasjon gjentatt for totalt 2 injeksjoner i et tre-dagers intervall 17. </li><li> 3 dager etter den andre injeksjonen, ta 10 mL halen blod fra hver PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG mus og måle blod Ca ++ bruker en Blood Gas System Ca ++ / pH analysator. MERK: Vi definerer mus med blod ionisert Ca ++ lavere enn 1,18 mmol / L som hypoparathyroid mus, noe som tilsvarer 2 SD under gjennomsnittet av kjøretøy-injisert kontroll mus (n = 22). </li></ol>

<ol>
	<li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hypoparathyroidism. , (2015).</li><li>van Abel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+renal+Ca(2+)+transport+proteins+by+parathyroid+hormone.">Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone.</a> Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).</li><li>Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+intermittent+PTH(1-34)+and+PTH(7-34)+on+bone+microarchitecture+and+aortic+calcification+in+experimental+renal+failure.">Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure.</a> Bone. 43, 1022-1030 (2008).</li><li>Rodriguez-Ortiz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+deficiency+reduces+circulating+levels+of+FGF23.">Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).</li><li>Liao, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Fibroblast+Growth+Factor+23+and+Biochemical+and+Bone+Histomorphometric+Alterations+in+a+Chronic+Kidney+Disease+Rat+Model+Undergoing+Parathyroidectomy.">Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy.</a> PloS one. 10, e0133278 (2015).</li><li>Fox, J., Care, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+low+calcium+and+low+phosphorus+diets+on+the+intestinal+absorption+of+water+in+intact+and+parathyroidectomized+pigs.">Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs.</a> Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).</li><li>Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+parathyroidectomy+of+the+dog.">Selective parathyroidectomy of the dog.</a> Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).</li><li>Can, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parathyroid+allotransplantation+in+rabbits+without+cultivation.">Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation.</a> Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).</li><li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice.">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li><li>Sakai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+development+in+immobilized+bone+is+suppressed+by+parathyroidectomy+in+mice.">Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice.</a> J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).</li><li>Miao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+abnormalities+in+Pth-null+mice+are+influenced+by+dietary+calcium.">Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium.</a> Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).</li><li>Gunther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablation+of+parathyroid+glands+reveals+another+source+of+parathyroid+hormone.">Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone.</a> Nature. 406, 199-203 (2000).</li><li>Hough, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+calcium-sensing+receptor+mutation+in+the+mouse+is+associated+with+cataracts+and+ectopic+calcification.">Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).</li><li>Hannan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calcilytic+Agent+NPS+2143+Rectifies+Hypocalcemia+in+a+Mouse+Model+With+an+Activating+Calcium-Sensing+Receptor+(CaSR)+Mutation:+Relevance+to+Autosomal+Dominant+Hypocalcemia+Type+1+(ADH1).">The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1).</a> Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).</li><li>Libutti, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parathyroid+gland-specific+deletion+of+the+mouse+Men1+gene+results+in+parathyroid+neoplasia+and+hypercalcemic+hyperparathyroidism.">Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism.</a> Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).</li><li>Bi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+Toxin-+and+GFP-Based+Mouse+Models+of+Acquired+Hypoparathyroidism+and+Treatment+with+a+Long-Acting+Parathyroid+Hormone+Analog.">Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Buch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-inducible+diphtheria+toxin+receptor+mediates+cell+lineage+ablation+after+toxin+administration.">A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration.</a> Nat Methods. 2, 419-426 (2005).</li><li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice.">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Vi demonstrerer teknikken av GFP-guidet paratyreoidektomi bruker transgene mus med GFP uttrykk selektivt i biskjoldkjertlene. I PTHcre, mTmG mus, dobbel fluorescens (den grønne GFP i Cre-uttrykt celler og rød tomat i ikke-Cre uttrykt celler) gjort oss i stand til å identifisere og presist fjerne alle biskjoldkjertlene uten å fjerne thyroids. Selv om vi foretrekker å bruke den doble fluorescens mTmG mus for evnen til å identifisere fluorescerende røde non-parathyroid vev, bør vår prosedyre også fungere godt ved hjelp av enkle fluorescerende dyr som tomat rød (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Fremgangsmåten er relativt enkel å utføre, krever omtrent 20 min per mus, og resulterer i en alvorlig og vedvarende hypoparathyroid fenotype. I tillegg er en annen fordel av GFP-positive biskjoldkjertlene er den enkle påvisning av avvikende biskjoldkjertlene. Våre studier visermislocalization av parathyroids i omtrent en fjerdedel av B6-mus (figur 1), som er lett oppdages i vår musemodell av den grønne fluorescens. I motsetning til thyro-paratyreoidektomi, unngår vår teknikk fjerning av skjoldbruskkjertelen med påfølgende behov for skjoldbruskkjertelhormon og den ukjente effekten av fjerning av calcitonin-produserende thyroid C-celler. Fluorescensmerkede biskjoldkjertlene kan også anvendes for andre undersøkelser som krever isolering av biskjoldkjertlene. Begrensningen av denne modellen inkluderer kravet om kirurgi. Grunnleggende mikrokirurgi ferdigheter og en disseksjon mikroskop med et fluorescerende lyskilde er påkrevd. En annen teknikk for å generere hypoparathyroid mus som eliminerer behovet for kirurgi er demonstrert. Difteri toksin-behandlede PTHcre-IDTR mus viser en mildere hypoparathyroidism fenotype, men bare trenger å injisere DT intraperitonealt i musen. Den kritiske delen for generere denne modellen ble optimalisering av dosering og doseringsregime. Høye doser av DT førte til toksisitet, men lave doser reduserte effekten av tilnærmingen. Vi bestemte at dosen regiment av 2 injeksjoner på 5 mikrogram / kg, administrert 3 dager fra hverandre, førte pålitelig og stabil hypokalsemi med ingen / minimal dødelighet. Til syvende og sist, håper vi at disse to tilnærmingene gi nyttige musemodeller for ervervet hypoparathyroidism. Ved hjelp av en ny langtidsvirkende PTH, rapporterte vi den første bruk av begge disse modellene i å bestemme effekten av nye legemidler for hypoparathyroidism 17.

Siden den første systematisk beskrivelse av biskjoldkjertlene i mennesker og i flere andre arter av Sandström i 1880 en, forstå betydningen av denne lille endokrine organ for menneskets fysiologi og sykdoms har kontinuerlig forbedret. Parathyroid kjertler skiller parathyreoideahormon (PTH), rektor regulator av kalsium metabolisme. PTH er også et viktig hormon for fosfat homeostase og benomsetning 1, 2. Utilsiktet fjerning eller skade av parathyroids under halskirurgi er den vanligste årsaken til hypoparathyroidism, en sykdom preget av lav blod kalsium, lav PTH, og forhøyede fosfor 1. Å bedre studie kjøpt hypoparathyroidism og teste nye behandlingsformer, pålitelig og lett tilgjengelige musemodeller er påkrevd. Mus som er mye brukt i forskning, fordi en rekke genetiske verktøy er enTilg hos denne arten tillater sofistikerte mekanistiske studier in vivo. Men mens kirurgisk paratyreoidektomi (PTX) kan brukes i rotter 2, 3, 4, 5 og større pattedyr 6, 7, 8, er det teknisk meget krevende i mus på grunn av den lille størrelsen av kjertler og deres variable anatomisk fordeling 9. Derfor er thyro-paratyreoidektomi (TPTX) vanligvis utført på mus, der skjoldbruskkjertelen og parathyroid kjertler fjernes sammen 10. Men lave skjoldbrusk hormon nivåene er en potensiell confounder i eksperimenter, kompliserer denne modellen. I tillegg er C-celler i skjoldbruskkjertelen, som produserer kalsitonin, et hormon viktig i kalsiumhomeostase hos gnagere, også tapt i forbindelse med fjerning av thyroids 11. Flere genetiske musemodeller av hypoparathyroidism eksisterer, som inkluderer PTH-null mus 12, den GCM2-null mus 13, og Nuf mus med en aktiverende mutasjon i kalsium-sensing reseptor (CaSR) 14, 15. Men disse genetiske defekter allerede er til stede under embryonal utvikling og funksjon av parathyroids derfor allerede er svekket i løpet av embryogenesen. Dette kan påvirke utviklingen av organer som skjelett. Dette i motsetning til pasienter med postsurgical hypoparathyroidism som erverver sykdommen senere i livet. Dessuten har enkelte av disse musemodeller utviser tidlig dødelighet og redusert fertilitet, noe som ytterligere kompliserer deres bruk 12, 13, 14. Vi har utviklet to nye mus models for ervervet hypoparathyroidism. Ved hjelp av genmodifiserte mus som uttrykker GFP spesielt i parathyroids gjør biskjoldkjertlene å bli lett identifiseres for kirurgisk fjerning uten å fjerne skjoldbruskkjertelen. Denne mus ble generert ved passering av PTH-Cre mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av den 5,5 kb PTH-promoteren 16 med ROSA mTmG mus. De resulterende PTHcre; mTmG mus uttrykker grønt fluorescerende protein spesifikt i parathyroid celler. Den andre musemodell benytter den samme PTH-Cre, denne gang for å fjerne en STOP-kassetten fra den induserbare DTR mus, noe som resulterer i ekspresjon av difteri-toksin-reseptoren spesifikt i de parathyroids. Systemisk administrasjon av DT ødelegger parathyroid celler, gjengi dyrene hypoparathyroid uten kirurgi. De to musemodeller som presenteres i denne studien viser en stabil hypokalsemisk fenotype over tremåneders observasjons period. Prosedyrene er enkle å utføre, er fenotype reproduserbar, og hypoparathyroid mus viser en høy overlevelse 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:188px;">ROSAmT/mG mice</td>
			<td style="width:183px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:108px;">7676</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">PTH-Cre mice</td>
			<td style="width:183px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:108px;">5989</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">iDTRmice</td>
			<td style="width:183px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:108px;">7900</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">6-0 polyglactin 910 suture with needle</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon, Inc</td>
			<td style="width:108px;">J510G</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">Safety Single Edge Razor Blades</td>
			<td style="width:183px;">American Safety Razor Company</td>
			<td style="width:108px;">66-0089</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">Disposable Scalpel</td>
			<td style="width:183px;">Feather Safety Razor Co., LTD</td>
			<td style="width:108px;">72042-11</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">Povidone-Iodine Prep Pads</td>
			<td style="width:183px;">Dynarex Corporation</td>
			<td align="right" style="width:108px;">1108</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">Ply gauze</td>
			<td style="width:183px;">Busse. Inc</td>
			<td style="width:108px;">BHD707</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">0.9% Sodium Chloride Solution</td>
			<td style="width:183px;">HOSPIRA Worldwide, Inc</td>
			<td style="width:108px;">07983-09</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">1mL 29G Insulin Syringe</td>
			<td style="width:183px;">BECTON DICKINSON</td>
			<td align="right" style="width:108px;">329622</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">Surgical Incise Drapes</td>
			<td style="width:183px;">3M</td>
			<td style="width:108px;">6640EZ</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">Dumstar Biology forceps</td>
			<td style="width:183px;">Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td>
			<td style="width:108px;">RS-4984</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:183px;">Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td>
			<td style="width:108px;">RS-5605</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:183px;">MILTEX.,Inc</td>
			<td style="width:108px;">V98-42</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:188px;">2,2,2-Tribromethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">T48402</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:188px;">2-Methyl-2-Butanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:108px;">152463</td>
			<td style="width:197px;">For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:188px;">Diphtheria Toxin Powder</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">D0564</td>
			<td style="width:197px;">Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:188px;">Multicap Blood Collection Capillary tubes</td>
			<td style="width:183px;">Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td>
			<td align="right" style="width:108px;">855578</td>
			<td style="width:197px;">For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:188px;">RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer</td>
			<td style="width:183px;">Siemens Healthcare</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:197px;">For iCa2+ analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using gfp glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP. 
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

Plassering av biskjoldkjertlene Først registrerte vi fordelingen av biskjoldkjertlene av 54 PTHcre-mTmG mus som observert under fluorescerende disseksjon mikroskop. 74% (40/54) mus hadde to grønne biskjoldkjertlene (figur 1A, C, E), 26% (14/54) mus hadde en ekstra tredje biskjoldbruskkjertelen (figur 1 B, D, F). Ingen mus med en enkelt kjertel eller mer enn tre kjertlene ble observert. Vanligvis biskjoldkjertlene ble plassert i nærheten av overlegen grensen av skjoldbruskkjertelen (58%, 71/122, figur 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) kjertler ble plassert i nærheten av dårligere grensen av skjoldbruskkjertelen (figur 1C (1), D (3), F (1)), og 13% (16/122) ble plassert bort fra thyroid kjertel (figur 1B (3), E (1), F (2)). Våre funn er i samsvar med og bygge på tidligere funn av varierende steder av biskjoldkjertlene 20. GFP-PTX Mus Hele operasjonen fra anestesi til å lukke huden snitt tok ca 20 min per mus. Overlevelsesraten av postsurgical mus i løpet av en tre-måneders observasjonsperioden var 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) GFP-PTX mus viste ioniserte kalsiumnivåer som var 2 SD under gjennomsnittet av humbug-opererte kontroll mus eller lavere. Den hypoparathyroid fenotype i GFP-PTX mus (hypokalsemi, lav PTH og forhøyet serum fosfat) var stabil for hele observasjonsperiode på 3 måneder. Viktigere, skjoldbruskkjertelen var ikke annerledes enn humbug-opererte dyr 3 måneder etter operasjonen (TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 mg / dl, p = 0,707 (figur 2). PTH-CRE-IDTR Mus DT injiserte PTH-Cre-IDTR musene hypoparathyroidism (lav blod ionisert kalsium, forhøyet blod fosfor, og urimelig lav-normal PTH-nivåer). Vi har tidligere rapportert at noen PTH-positive celler unnslippe ablasjon av difteritoksin, forklarer den målbare sirkulerende PTH og derfor noe mildere fenotypen til disse musene 17. Hypoparathyroidism i GFP-PTX Mus og PTH-CRE-IDTR Mus Betydelige reduksjoner av blod Ca ++ og serum PTH-nivåer ble observert i GFP-PTX mus 3 dager etter operasjonen, sammenlignet med nivåene funnet i sham-opererte mus (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 32 ± 22 vs. 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). Den hypoparathyroidism fenotype var stabil over 3-måneders observasjonsperiode (figur 3A, gjengitt med tillatelse fra (referanse # 17)). Etter 2 injeksjoner med 5 mikrogram / kg DT på tre dager intervall, en dose og diett optimalisert for å bruke minst mulig DT for å gi maksimal hypoparathyroid fenotype, DT injiserte PTH-Cre-IDTR mus viste signifikant hypokalsemi og redusert PTH i forhold til kjøretøy kontroll mus, noe som vedvarte over 90 dager observasjonsperioden (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / L vs. 1,26 ± 0,05 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs. 572 ± 164 pg / ml, p &lt;0,05) (figur 3B, gjengitt med tillatelse fra (referanse # 17)). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figur 1: <strong&gt; Representative bilder av forskjellige steder i biskjoldkjertlene i 54 PTHcre-mTmG Mus under fluorescerende Dissection mikroskop. Mus hadde enten to (A, C, E) eller tre (B, D, F) grønne biskjoldkjertlene. Mest biskjoldkjertlene ble plassert i nærheten av overordnet ramme (A (1,2) B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) eller i nærheten av den nedre grense av skjoldbruskkjertelen (C (1), D (3), F (1)). i sjeldne tilfeller, noen ble plassert ectopically (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figur 2: TSH og T4 nivå av GFP-PTX Mus. 3 måneder etter GFP-PTX, ble serum oppnådd for TSH og T4 måling uten<html> entene. GFP-PTX mus viste TSH-konsentrasjoner (42 ± 24 mU / L) (A) og T4 konsentrasjoner (3,0 ± 0,6 mg / dl) (B) som ikke var forskjellige fra kontrollmusene (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figur 3: Blood Ca ++ og PTH-nivået i GFP-PTX Mus og DT Støpt PTH-Cre-IDTR Mus. Begge GFP-PTX mus (A) og DT injiserte PTH-Cre-IDTR mus (B) viste stabil hypokalsemi og redusert PTH-nivået i løpet av tre måneders observasjonsperioden (N = 6-8, *** p &lt;0,001) (gjen trykt med tillatelse fra referanse # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Watch this Scientific Journal Video about Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation at JoVE.com

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

To teknikker for å skape Hypoparathyroid Mus: paratyreoidektomi Bruke GFP kjertler og difteri-gift-mediert biskjoldbruskkjertelen Ablation

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Inducing Myointimal Hyperplasi Versus Åreforkalkning i Mus: En introduksjon av to gyldige modeller

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Akutt Brain Trauma i Mus fulgt av Langsgående To-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Robotic Ablation of Atrial Fibrillation

Robotic ablasjon av atrieflimmer

Background: Pulmonary vein isolation (PVI) is an established treatment for atrial fibrillation (AF). During PVI an electrical conduction block between ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

En enkel mekanisk prosedyre for å opprette limbale Stem Cell Mangel på Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Techniques of Sleeve Gastrectomy and Modified Roux-en-Y Gastric Bypass in Mice

Teknikker for Sleeve gastrektomi og Modified Roux-en-Y gastrisk bypass i Mus

Obesity is a major public health issue, with a prevalence of 4 to 28% for men and 6.2 to 36.5% for women in Europe (from 2003 to 2008). Morbid obesity is ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

I Vivo Imaging for Cx3cr1gfp/gfp Reporter mus Spectral domener Optical Coherence tomografi og skanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Ablation of Ischemic Ventricular Tachycardia Using a Multipolar Catheter and 3-dimensional Mapping System for High-density Electro-anatomical Reconstruction

Ablasjon iskemiske ventrikkel takykardi bruker Multipolar kateter og 3-dimensjonale kartsystem høy tetthet Electro-anatomiske gjenoppbygging

Ventricular tachycardia (VT) in patients with ischemic cardiomyopathy mainly results from endocardial scars after myocardial infarction; those scars ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protokoll for å skape kroniske sår i diabetiker mus

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Two-Dimensional X-Ray Angiography to Examine Fine Vascular Structure Using a Silicone Rubber Injection Compound

Todimensjonal røntgen Angiography undersøke Fine Vaskulær struktur med en silikon gummi injeksjon sammensatt

Angiography is an essential tool for the study of vascular structures in various research fields. The aim of this study is to introduce a simple ...

Surgical Techniques to Optimize Ovarian Reserve during Laparoscopic Cystectomy for Ovarian Endometrioma

Kirurgiske teknikker for å optimalisere ovariereservat under Laparoskopisk cystektomi for ovarial endometrioma

Surgical management of ovarian endometrioma in patients desiring fertility is complicated by the need to balance maximal resection of disease with efforts ...