Name: a method for measuring metabolism in sorted subpopulations of complex cell communities using stable isotope tracing
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00
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The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. metabolito Extração <ol><li> Extração de prato <ol><li> células de cultura em uma placa de 6 poços em triplicado em isótopos marcados meios de cultura estáveis ​​+ suplementos dialisados ​​(soro ou outros suplementos de crescimento) até que as células se tornam 75% confluentes. NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 h em RPMI contendo 40% U- 13 C-glicose e 70% U- 13 C, 15 N2-glutamina e 5% de FBS dialisado (Soro Bovino Fetal). FBS d...

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	<li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system.">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li><li>Heppner, G. 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L., Sivridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metabolic+pathways+between+cancer+cells+and+stromal+cells+in+colorectal+carcinomas:+A+metabolic+survival+role+for+tumor-associated+stroma.">Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma.</a> Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).</li><li>Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiles+of+human+immunodeficiency+virus+infected+CD4++T+cells+and+macrophages+using+LC-MS/MS+analysis.">Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis.</a> Virology. 415 (2), 153-159 (2011).</li><li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+FACS+perturb+gene+expression.">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).</li><li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots.">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li><li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells.">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32 (2014).</li><li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells.">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li><li>Shapiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2003).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Noack, S., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolomics:+A+phantom.">Quantitative metabolomics: A phantom.</a> Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).</li></ol>

O nosso método é baseado no princípio de que em MIDs metabolitos celulares reflectir a &quot;história&quot; de actividades metabólicas de uma célula. Isto faz com que seja possível investigar actividades metabólicas na subpopulação de células, uma vez que ocorreram na comunidade complexo de células, antes do processo de separação de células. Em contraste, as áreas dos picos de metabólitos diferem acentuadamente entre os extratos de células classificadas e extração direta da placa de cultura <sup clas...

organismos superiores contêm comunidades complexas de tipos de células distintas que colaboram para funções mais complexas. Por exemplo, tumores contêm não só as células cancerosas, mas também fibroblastos, células que constituem os vasos sanguíneos, e muitas vezes de células imunes infiltrados 1; sangue contém uma mistura complexa de dezenas de subtipos de células imunológicas 2; e ainda linhas de células cultivadas pode ser constituída por várias subpopulações, tal como o lúmen e subtipos de células basais do cancro da mama 3. Além disso, os tipos de células distintas que coexistem podem exibir &quot;colaboração&quot; metabólica. Por exemplo, no cérebro, astrócitos são pensados para converter a glicose em lactato, o qual é, em seguida, &quot;alimentado&quot; para os neurónios que oxidam este substrato 4; Os linfócitos T são, em alguns contextos dependentes de células dendríticas adjacentes como uma fonte de cisteína 5; e as células cancerosas podem colaborar com assofibroblastos ciados em tumores 6. Para compreender o comportamento metabólico de tais sistemas, é essencial para separar e medir as actividades metabólicas dos vários tipos de células presentes. De longe, o método mais amplamente utilizado para a separação de tipos de células é a classificação de células activadas por fluorescência. Este método é amplamente aplicável, desde que o tipo de célula ou do estado de interesse podem ser &quot;etiquetados&quot; utilizando anticorpos fluorescentes, a expressão de proteínas fluorescentes modificadas, ou outros corantes. Uma opção é tipos de células inicialmente separadas por meio de um classificador de células, re-cultura os tipos de células individuais obtidos, e em seguida, realizar estudos sobre o metabolismo destas culturas 7. No entanto, isto só é possível se o tipo de célula ou fenótipo é estável nas condições de cultura, e não pode captar o comportamento transiente tais como estados do ciclo celular, nem a cooperação metabólica em co-culturas. Para tais casos, o metabolismo deve ser medida directamente no assimcélulas rted. Este é um desafio desde a célula procedimento de triagem submete células a tensões que possam falsear o seu metabolismo 8, e estamos cientes de apenas alguns estudos que tomam esta abordagem 9, 10. Em particular, verificou-se que os principais metabolitos, tais como aminoácidos pode vazar a partir de células mantidas em tampão de separação de células, de modo que as medições de abundância metabolito absoluta não são fiáveis 11 (embora comparação relativa entre as fracções ordenadas podem ainda ser valiosos). Para contornar esses problemas, nós rotulamos células com isótopos estáveis ​​antes de triagem, e focar os MIDs em metabólitos celulares, em vez de abundâncias de metabólitos. Desde MIDs são formados em escalas de tempo mais longos, devem ser menos afetados pela exposição a curto prazo às condições de classificação. Nós quantificar MIDs usando espectrometria de massa de alta resolução-scan completo, que é sensível o suficiente para fornecer data em centenas de metabólitos a partir de cerca de 500.000 células classificadas, necessitando de cerca de 30-60 minutos de tempo de separação de células. Uma comparação entre um &quot;simulada&quot; classificados de controlo (células passados ​​através do instrumento de separação de células, sem qualquer gating população específica) e extracção metabolito directamente a partir da placa de cultura é feita para garantir que os médios observados são representativos daqueles na cultura original. Dependendo da escolha dos marcadores de isótopos estáveis, várias vias metabólicas podem ser estudada com este método.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1001">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">H6648</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td>
			<td style="width:165px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-13C-Glucose</td>
			<td>Cambridge isotopes</td>
			<td>40762-22-9 / GLC-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-13C,15N2-Glutamine</td>
			<td>Cambridge isotopes</td>
			<td>CNLM-1275-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (JT Baker), HPLC grade</td>
			<td style="width:165px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">BAKR8402.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:165px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;">UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultimate 3,000 UHPLC</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:165px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:139px;">1.50444.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20x2.1 mm)</td>
			<td style="width:165px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milli-Q water</td>
			<td style="width:165px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Produced with a Milli-Q Gradient system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid)</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11423423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32x11.6mm,amber, 100 units</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;">10560053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps)</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;">12458636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">MSCAL5</td>
			<td>Calibration kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SNAKESKIN 10K MWCO&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;">88245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mathematica v.10&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Wolfram Research</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for measuring metabolism in sorted subpopulations of complex cell communities using stable isotope tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

Como um exemplo, aqui descrevemos uma experiência investigar o metabolismo das células HeLa classificados de acordo com a fase do ciclo celular. Para identificar uma grande variedade de metabolitos centrais em ambos os átomos de carbono e átomos de azoto, que as células cultivadas durante 48 h, usando U- 13 C-glicose e U- 13 C, 15 N-glutamina como marcadores. Para obter MIDs ricos para a experiência de validação, que escolheu uma mistura de 40% U-...

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

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