Name: sorla and clc:clf-1-dependent downregulation of cntfr&#945; as demonstrated by western blotting, inhibition of lysosomal enzymes, and immunocytochemistry
Uploaded: 2017-01-06T10:45:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃŽÂ± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry at JoV

The authors have no acknowledgements.

1. Западная блоттинг лизатов CNTFRα <ol><li> Экспресс полнометражный sorLA и Мус-меченый CNTFRα строит в эмбриональной почки человека 293 (НЕК293) клеток с использованием пкДНК3.1 / Zeo (-) и pcDNA3.1 / Hyg (-), соответственно. Трансфекции клеток HEK293 с конструкты с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с постав-протоколу. Выберите стабильные клоны в среде , содержащей 150 мкг / мл Zeocin и / или 500 мкг / мл гигромицина Gold 13. </li><li> Семенной равное количество HEK293 трансфектантов выражения либо CNTFRα-Мус или коэкспрессирующей CNTFRα-Myc / sorLA в двух 4-луночных планшетах , как показано на рисунке 1. Культура клеток в среде Игла Модифицированные Eagle&#39;s Среда Игла (DMEM) , дополненной 10% плодной бычий сывороточный (ФБС), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (полная среда) в инкубаторе с 5% диоксида углерода в при 37 ° с. </li><li> Подождите, пока клетки не 50 - 80% сплошности. </li><li> Извлеките носитель изскважин, промыть один раз с Дульбекко фосфатно - солевом буферном (DPBS), и добавить свежую полную среду с использованием или без (контроль) 10 нМ CLC: КТМ-1 , как показано на рисунке 1. Инкубируйте клетки при 37 ° С. </li><li> После того, как 0 и 5 ч инкубации, восстановить среду и хранить его при температуре 4 ° С в 1,5 мл пробирки. Затем добавляют 1% Тритон Х-100 буфер для лизиса (20 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0) с добавлением ингибитором протеиназы коктейлем в каждую лунку (1 мин, 4 ° С). Впоследствии, передавать клеточные лизаты до 1,5 мл пробирки (4 ° С). </li><li> Спин пробирки, содержащие среды и клеточный лизат (3000 XG, 3 мин, 4 ° С) и передать супернатанты 1,5 мл пробирки (4 ° С). Выбросите осадок. Передача 5 мкл каждого клеточного лизата надосадочной к новым 1,5 мл пробирки - использовать их для измерения содержания белка позже (шаг 1.7). Немедленно добавьте невосстанавливающих LDS буфер выборки для всех супернатантах и ​​вихре образцы. </li><li> Используйте 5 мкл аликвоты для измерения Protсодержание Эйн в клеточных лизатов супернатантах с использованием коммерческого анализа белка в соответствии с протоколом производителя. </li><li> Тепло образцов при 95 ° С в течение 5 мин. </li><li> Индивидууму одинаковое количество белка из каждого образца для снижения SDS-PAGE 13 и вестерн - блоттинга 13 и визуализировать содержание sorLA, бета-актина и CNTFRα-Мус в среде и в клеточных лизатов с использованием кроличьего анти-sorLA 16 (5 мкг / мл), мышиное анти-β-актина (0,4 мкг / мл), и мышиное анти-Мус (1 мкг / мл) антитела и соответствующие ПХ-св занных вторичных антител (1: 2000). </li><li> Количественно полосы с помощью денситометрии в соответствии с протоколом производителя. </li></ol> 2. Иммуноцитохимическая в комбинации с лизосомальных ингибиторам <ol><li> Семенной НЕК293 , стабильно трансфицированные CNTFRα-Myc / sorLA на обложке слайды в 4-луночного планшета , как показано на рисунке 2. Культуры клеток в полной среде, как указано выше. </li><li>Подождите, пока клетка не стечение 20 - 40%. </li><li> Удалить среду из лунок и добавляют полную среду с использованием или без 50 мкг / мл лейпептина и пепстатина А (Leu / PEP) (ингибирует лизосомальные гидролаз) к клеткам , как показано на рисунке 2. Инкубируйте клетки при 37 ° С. Носитель должен быть заменен каждые 6 часов в течение следующих 24 ч инкубации. </li><li> Через 24 ч инкубации, еще раз замените носитель (с или без Лей / PEP) и на этот раз добавляют 10 нМ CLC: CLF-1. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 часов. </li><li> Промывают клетки один раз в PBS и зафиксировать их в 4% параформальдегид, рН 7 в течение 15 мин при комнатной температуре. Внимание: параформальдегид является высокотоксичным, избегать контакта с кожей, глазами и слизистой. Перчатки и защитные очки следует носить и решения на заказ внутри вытяжного шкафа. </li><li> Промывают клетки один раз в PBS и клетки проницаемыми в течение 5 мин при комнатной температуре в сапонина, разведенного в PBS (0,5% сапонина). </li><li> Развести козы к антигенам CNTFRα (1 мкг / мл) (в частности,не мышиное анти-Мус использовали для Вестерн-блоттинга), а также мышиное анти-LAMP-1 (15 мкг / мл) антител в 0,5% сапонина и инкубировать клетки с антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. </li><li> Промыть клетки 4 раза (5 мин) в 0,5% сапонина и инкубировать клетки с осла анти-козел Alexa 488- и осла против мышиного Alexa 568-конъюгированные вторичные антитела (6 мкг / мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. </li><li> Вымойте клетки 4x (5 мин) в 0,5% сапонина, дважды в деионизированной воде (1 мин), а также крепление крышки слайдов на предметные стекла микроскопа с помощью монтажного средства массовой информации. </li><li> Анализировать антитело-окрашивание клеток с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с целью погружения в воду в 63X C-Apochromat, NA 1.2. </li></ol> 3. Вестерн-блот-определение уровня pSTAT3 <ol><li> Семенной HEK293-sorLA клетки (которые выражают эндогенные уровни CNTFRα) в 4-луночного планшета , как показано на рисунке 3. Культуры клеток в полной среде, как указано выше. </li><li> Подождите, покаКлетки 50 - 80% сплошности. </li><li> Удалите среду из лунок, мыть один раз в PBS, и добавить свежую полную среду с или без 10 нМ CLC: CLF-1 к клеткам , как показано на рисунке 3. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 часов. </li><li> Извлеките носитель, промыть клетки дважды в DMEM без добавок (пустой среде, без FBS и антибиотиков), а затем reincubate клетки в течение 90 мин (при 37 ° С) в пустой среде. </li><li> Еще раз, удалите среду и добавьте свежую чистую среду с или без 5 нМ CLC: CLF-1 (для инициирования STAT3 фосфорилирования) , как показано на рисунке 3. Инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С. </li><li> Быстрое удаление среды и лизиса клеток (1 мин, 4 ° С) путем добавления 1% Тритон Х-100 буфер для лизиса (20 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0) с добавлением ингибитор протеиназы коктейль и ингибитор фосфатазы коктейль в каждую лунку. Впоследствии, передавать клеточные лизаты до 1,5 мл пробирки (4 ° С). </li><li> Передача 5 мкл Oе каждый супернатант к новым 1,5 мл пробирки - использовать их для измерения содержания белка позже (шаг 3.8). Немедленно добавьте невосстанавливающих LDS буфер выборки для всех супернатантах и ​​вихре образцы. </li><li> Измеряют содержание белка в аликвотах по 5 мкл с использованием коммерческого анализа белка в соответствии с протоколом производителя. </li><li> не Разрушать ультразвуком каждого образца при комнатной температуре, пока они больше не вязким (приблизительно 1 мин), а затем нагревают их при температуре 95 ° С в течение 5 мин. </li><li> Индивидууму одинаковое количество белка от каждого образца SDS-PAGE 13 и вестерн - блоттинга 13 и визуализировать содержание pSTAT3 и общего STAT3 в клеточных лизатов с использованием кроличьего анти-pSTAT3 (1: 2000) и мышиного анти-STAT3 (1: 1000 ) антитела и соответствующие ПХ-сшитый мышиные и кроличьи вторичные антитела (1: 2000). </li><li> Количественно полосы с помощью денситометрии в соответствии с протоколом производителя. </li></ol>

<ol>
	<li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLF+associates+with+CLC+to+form+a+functional+heteromeric+ligand+for+the+CNTF+receptor+complex.">CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex.</a> Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).</li><li>Senaldi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+neurotrophin-1/B+cell-stimulating+factor-3:+a+cytokine+of+the+IL-6+family.">Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).</li><li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-like+factor-1,+a+novel+soluble+protein,+shares+homology+with+members+of+the+cytokine+type+I+receptor+family.">Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family.</a> J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).</li><li>Lelievre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+recruited+by+the+cardiotrophin-like+cytokine/cytokine-like+factor-1+composite+cytokine:+specific+requirement+of+the+membrane-bound+form+of+ciliary+neurotrophic+factor+receptor+alpha+component.">Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component.</a> J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).</li><li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Death+in+Mice+Lacking+Cardiotrophin-Like+Cytokine+(CLC)+is+Associated+with+Multifocal+Neuronal+Hypoplasia.">Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia.</a> Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).</li><li>Forger, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiotrophin-like+cytokine/cytokine-like+factor+1+is+an+essential+trophic+factor+for+lumbar+and+facial+motoneurons+in+vivo.">Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo.</a> J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).</li><li>Alexander, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suckling+defect+in+mice+lacking+the+soluble+haemopoietin+receptor+NR6.">Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6.</a> Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).</li><li>DeChiara, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+the+CNTF+receptor,+unlike+mice+lacking+CNTF,+exhibit+profound+motor+neuron+deficits+at+birth.">Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth.</a> Cell. 83 (2), 313-322 (1995).</li><li>Crisponi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisponi+syndrome+is+caused+by+mutations+in+the+CRLF1+gene+and+is+allelic+to+cold-induced+sweating+syndrome+type+1.">Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1.</a> Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).</li><li>Crisponi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+recessive+disorder+with+muscle+contractions+resembling+neonatal+tetanus,+characteristic+face,+camptodactyly,+hyperthermia,+and+sudden+death:+a+new+syndrome.">Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome.</a> Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).</li><li>Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-induced+profuse+sweating+on+back+and+chest.+A+new+genetic+entity.">Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity.</a> Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).</li><li>Guillet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+active+fusion+protein+of+the+novel+composite+cytokine+CLC/soluble+CNTF+receptor.">Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor.</a> Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).</li><li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-Like+Factor+1,+an+Essential+Facilitator+of+Cardiotrophin-Like+Cytokine:Ciliary+Neurotrophic+Factor+Receptor+alpha+Signaling+and+sorLA-Mediated+Turnover.">Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).</li><li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function.">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li><li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+novel+human+hybrid-type+receptor+that+binds+the+alpha2-macroglobulin+receptor-associated+protein.">Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein.</a> J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+by+the+cytoplasmic+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+binding+receptor+SorLA.">Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA.</a> Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).</li><li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sorLA+cytoplasmic+domain+interacts+with+GGA1+and+-2+and+defines+minimum+requirements+for+GGA+binding.">The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding.</a> FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).</li><li>Klinger, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA+regulates+the+activity+of+lipoprotein+lipase+by+intracellular+trafficking.">SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking.</a> J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).</li><li>Kitago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+amyloidogenic+peptide+recognition+by+sorLA.">Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).</li><li>Quistgaard, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+bind+to+Sortilin+in+the+tunnel+of+a+ten-bladed+beta-propeller+domain.">Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain.</a> Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).</li><li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+sorCS1+binds+sortilin+and+hampers+its+cellular+functions.">Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions.</a> Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).</li><li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortilin+facilitates+signaling+of+ciliary+neurotrophic+factor+and+related+helical+type+1+cytokines+targeting+the+gp130/leukemia+inhibitory+factor+receptor+beta+heterodimer.">Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer.</a> Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Протокол, описанный здесь, может быть использован специально для демонстрации sorLA-опосредованную CLC: КТМ-1-зависимой деактивация и лизосомальная нацеливание CNTFRα, а также сопутствующее ослаблена реакция на CLC: КТМ-1 стимуляции. Клеточной линии HEK293 хорошо подходит для этого протокола, поскольку они имеют лишь незначительную эндогенную экспрессию CNTFRα и sorLA, легко трансфекцию, экспресс-gp130 / LIFRβ, и имеют большое тело клетки, которое подходит для иммуногистохимии. Тем не менее, в теории любой клеточной линии с аналогичными свойствами должна работать. Протокол имеет два важнейших этапа. Первый из них касается шаг 2,3, в котором Leu / PEP среда должна быть заменена примерно каждые 6 часов в течение 24 часов. Несоблюдение этого правила может привести к активным лизосомальных ферментов и меньше или без заметного накопления белка в лизосомах. Второй важный шаг (3.4) относится стирка при предварительной инкубации с CLC: КТМ-1. Это имВАЖН для удаления несвязанного лиганда, и дать время клеткам восстановиться (избегая постоянной стимуляции) в DMEM (неполной эндотелиальной пустой среды). Это позволит обеспечить низкий фоновый уровень pSTAT3 во время последующей повторной стимуляции с CLC: КТМ-1 (шаг 3.5). Следует отметить, что рисунок 6 показывает , что клеточный ответ (pSTAT3) уменьшается параллельно с sorLA-опосредованной понижающей регуляции CNTFRα. Следует подчеркнуть, однако, что, хотя снижение реакции в соответствии с (и следовало ожидать от) уменьшение пула CNTFRα, это не доказывает, что низкая экспрессия CNTFRα в одиночку приходится уменьшенного клеточного ответа. Таким образом, изменения - в результате предварительной стимуляции или трансфекция - в любой из функциональных элементов сигнального пути вверх по течению к pSTAT3, возможно, внесли свой вклад в измененном ответ. Основная концепция протокола не ограничивается этим particuлар система рецептора. (Т. Е другой клеточной линии, и другие антитела, другие лиганды, и т.д.) Изменяя протокол может быть использован для определения индуцированной лигандом понижающей регуляции других рецепторов , а также - независимо от участия sorLA&#39;s. Тем не менее, следует отметить , что анализ рецепторного-понижающей с помощью вестерн - блоттинга, в основном , подходит для рецепторов, например, GPI-привязанный рецепторы, которые обнаруживают медленный оборот и низкую степень нового синтеза в нестимулированных клетках. Таким образом, в рецепторах, показывающие высокий уровень нового-синтеза, лиганд-индуцированной деактивация могут быть компенсированы путем синтеза новых рецепторов. В этих обстоятельствах, понижающая регуляция пула рецепторов вместо этого может быть определено с помощью метаболических маркировки и пульс-чейз экспериментов , как описано в 21. В качестве альтернативы, йодированные антитела (предпочтительно Fc-фрагменты), которые не вмешиваются связывания с рецептором может быть использован для &quot;метки&quot; эктодомена Receptили, и ожидаемый деактивация может затем быть определено путем подсчета радиоактивного осадка клеток и среды. По материально-техническим причинам мы трансфецировали наши клетки с CNTFRα построить несущий Myc-метки, а в настоящем протоколе мышиного анти-Мус антитела использовали для Вестерн-блот-обнаружения рецептора. В противоположность этому, козий анти-CNTFRα использовали антитела для иммуногистохимии и двойной маркировки в качестве LAMP-1 был обнаружен с помощью мышиного антитела - и, очевидно, использование двух первичных антител мыши будет приводить к неспецифической (перекрытие) окрашиванием вторичными антителами. Обратите внимание, что, так как козий анти-CNTFRα также работает в вестерн-блоттинга (не показан), протокол может быть легко модифицирован и применен к клеток, трансфицированных немаркированной CNTFRα. И, наконец, в последнее время было показано , что также эндоцитотический sortilin рецептор связывает CLC: CLF-1 с высоким сродством 22. Таким образом, можно предположить, что sortilin, какsorLA, межблочные CLC: CNTFRα через CLF-1 и может быть посредником эндоцитоза и лизосомальных адресности CNTFRα, а также. Использование sortilin вместо sorLA, настоящий протокол может быть использован для выяснения этого вопроса.

CLC и КТМ-1 представляют собой две субъединицы гетеродимерным цитокина CLC: CLF-1 1-3. Для индукции клеточного сигнала, CLC: КТМ-1 первый Целевые показатели CNTFRα, его первичная и ГПИ-привязанный-рецептор, чтобы сформировать связанный с мембраной тримерный комплекс. CLC: КТМ-1: CNTFRα комплекс затем рекрутирует gp130 / LIFRβ , которая опосредует сигнализации трансмембранный через Янус - киназа / преобразователи сигналов и активаторов транскрипции 3 (JAK / STAT3) пути 4. Мыши , дефицитные по любой из трех субъединиц отображения один и тот же фенотип и умирают в течение 24 ч после родов вследствие уменьшения количества лицевых нейронов и недостаточная сосунка 5-8. Полученные данные в организме человека аналогичным образом подчеркивают функциональную последовательность из трех субъединиц. Таким образом, человеческие мутации (гомозиготы или соединение), в результате чего дисфункция CLC: КТМ-1 или CNTFRα, все в результате синдрома так называемой холодной индуцированной потоотделение / Crisponi, состояние, характеризующееся такими симптомами, как impaiкрасный сосания и глотания, различные Дисморфоза особенности, температурные пики, и парадоксальным и заливать потливость при низких температурах 9-11. В пробирке, сочетание CLC и CNTFRα является необходимым и достаточным для взаимодействия с gp130 / LIFRβ и индукции сигнализации в клетках 12. Роль CLF-1 с другой стороны, менее ясна. Он не принимает непосредственного участия в передаче сигналов, и уже давно рассматривается в качестве приложения , который в основном служит для облегчения клеточного секреции CLC 1. Однако недавние исследования показывают, что КТМ-1 имеет дополнительные и более важные функции, как о причастности сигнализации и оборот CLC и CNTFRα. Таким образом, оказывается, что КТМ-1 содержит три независимых сайтов связывания: один для его хорошо известное связывание с КГО; который посредничает прямое связывание с CNTFRα; и третий (высокое сродство) сайт для взаимодействия с рецептором эндоцитоза sorLA. Как и CLC и КТМ-1 &amp; #, кажется,160; целевой CNTFRα со значительным меньшим сродством , чем CLC: КТМ-1 комплекса, можно предположить , что КТМ-1 ( с помощью своего сайта-связывающего CNTFRα) способствует объединению CLC и CNTFRα и тем самым облегчает сигнализации 13. Взаимодействие КТМ-1 с sorLA, основным вопросом настоящего представления, играет совершенно иную роль. SorLA является одним из пяти 1 -го типа рецепторов на которые составляют рецептор семейства 14 Vps10p-домена. Это выражается в различных тканях , но , в частности , в головном мозге и нервных тканей 15. Подобно другим членам семьи sorLA несет N-концевого лиганда Vps10p-домен, но кроме того, оно также включает в себя другие типы домен , включая лиганд-связывающих элементов , обнаруженных в члены рецептора липопротеинов семейства с низкой плотностью 15. Ее цитоплазматический хвост взаимодействует с несколькими адаптерных белков, например, адаптер белок-1 и -2 и sorLA передает эффективные endocytosэто так же как внутриклеточное сортировка и транспортировка связанных белков 16-18. Vps10p-домен содержит большое десяти лопастной бета-пропеллер 19,20, который связывает ряд несвязанных лигандов , в том числе CLF-1 (но в частности, не CLC) 13. Сайт связывания в CLF-1 доступен даже после того, как комплексообразование с CLC и CNTFRα , что означает , что sorLA связывает не только свободный КТМ-1, но также CLC: КТМ-1 и тример комплекс КРК: КТМ-1: CNTFRα 13. SorLA передает быстрое эндоцитоз CLF-1 и CLC: CLF-1, но они представляют собой растворимые белки, в то время как CNTFRα крепится к поверхности мембраны с помощью GPI-якоря. Поэтому вопрос состоит, если связывание CLC: КТМ-1: CNTFRα позволяет sorLA усваивать весь комплекс и, таким образом, чтобы изменять поверхность мембраны экспрессию CNTFRα (и последующую клеточную восприимчивость к CLC: индукция сигнала КТМ-1), и / или оборот CNTFRα. Эксперименты, описанные в настоящемотчет были разработаны, чтобы прояснить следующие вопросы: Есть ли посредником sorLA CLC: КТМ-1-зависимой понижающая регуляция поверхностной мембраны CNTFRα? Чтобы уточнить это, он был первоначально пытались определить оборот CNTFRα (в отсутствие и в присутствии sorLA) с помощью метаболических маркировки и пульс-чейз экспериментов , как описано в 21. Однако попытки маркировать CNTFRα с использованием смеси [S 35] цистеина и [S 35] показали , метионин плохое включение радиоактивности. Это позволяет предположить очень низкую степень нового-синтеза, который, по всей вероятности будет не в состоянии компенсировать внезапной и значительной потере рецепторов. Для того, чтобы определить, является ли CNTFRα была подавлена, когда соединены между собой с помощью CLC: КТМ-1 до sorLA, поэтому было решено просто измерить (с помощью Вестерн-блоттинга) общий клеточный пул CNTFRα до и после воздействия CLC: КТМ-1 - и сравнить результаты в клетках, трансфицированных или не трансфицировалиsorLA. предназначаться ли sorLA CNTFRα в лизосомы? Чтобы ответить на этот вопрос, локализация CNTFRα - усвоены через его CLC: КТМ-1-опосредованного связывания с sorLA - исследовали с помощью иммуноцитохимия, и этикетирование с антителами, направленными в сторону CNTFRα и поздних эндосом / лизосом маркера лизосом-ассоциированного мембранного белка 1 (LAMP-1). Эксперимент проводили на клетках, обработанных, а также необработанный с ингибиторами лизосомальных ферментов. Идея состояла в том, конечно, что если CNTFRα разжаловали в лизосомах, в клетках, обработанных ингибиторами фермента представит CNTFRα-окрашивание, накапливающейся в LAMP-1 положительных везикул, в то время как необработанные клетки показали бы мало или нет окрашивания для CNTFRα. Есть ли снизить CNTFRα деактивация клеточный ответ на CLC: CLF-1 стимуляции? Тример комплекс, состоящий из ХЖК, CLF-1 и сигналов CNTFRα через gp130 / LIFRβ гетеродимера с использованием JAK / STAT3путь. Соответственно, способность клеток реагировать на CLC: сигнализация КТМ-1 при понижающей регуляции CNTFRα была изучена с помощью Вестерн-блот-детекции и количественного определения на фосфо-STAT3 (pSTAT3) / общий уровень STAT3 в sorLA трансфектантов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B Gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 815 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates (Nunclon Delta Surface)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle&#180;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC:CLF-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1151-CL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-LAMP-1&#160;</td>
			<td>DSHP</td>
			<td>H4A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-sorLA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reference 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-b-actin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Myc</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>A00704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CNTFRa&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-pSTAT3&#160;</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>9145s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-STAT3&#160;</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>9139s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>7076s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>7074s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat HRP-linked antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8511-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,082,191,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA:Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,084,180,250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample Buffer (4X)&#160;</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97,135,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorla and clc:clf-1-dependent downregulation of cntfr&#945; as demonstrated by western blotting, inhibition of lysosomal enzymes, and immunocytochemistry

Гетеродимерный цитокин кардиотрофином-цитокина: цитокин-подобный фактор-1 (КРК: КТМ-1) ориентирована glycosylphosphatidylinositol (ИГП) -anchored CNTFRα с образованием тримерного комплекса, который впоследствии новобранцев гликопротеин 130 / ингибирующий лейкоз рецептор фактора-бета (gp130 / LIFRβ) для передачи сигналов. Оба CLC и CNTFRα необходимы для передачи сигналов, но до сих пор КТМ-1 был только известен как мнимого посредника CLC секреции. Тем не менее, в последнее время было показано, что КТМ-1 содержит три участка связывания: один для CLC; один для CNTFRα (что может способствовать сборки тримера комплекса); и один для эндоцитоза рецептора sorLA. Последний сайт обеспечивает высокую степень сродства связывания CLF-1, CLC: CLF-1, а также тримера (CLC: CLF-1: CNTFRα) комплекса к sorLA, и в sorLA-экспрессирующих клеток растворимые лиганды CLF-1 и CLC : КТМ-1 быстро забирали и усвоены. В клетках коэкспрессирующей CNTFRα и sorLA, CNTFRα первый связывает CLC: КТМ-1 с образованиеммембраносвязанным связанный тример комплекс, но он также подключается к sorLA через свободный sorLA-связывающий сайт в CLF-1. В результате, CNTFRα, который не имеет возможности для эндоцитоза на своего, дернул вдоль и усвоены sorLA-опосредованного эндоцитоза CLC: CLF-1. Настоящий протокол описывает экспериментальные процедуры, используемые для демонстрации I) sorLA-опосредованного и CLC: КТМ-1-зависимой понижающей регуляции поверхностной мембраны экспрессии CNTFRα; б) sorLA-опосредованного эндоцитоза и лизосомальная адресности CNTFRα; и III) пониженный клеточный ответ на CLC: CLF-1-стимуляции при sorLA-опосредованной понижающей регуляции CNTFRα.

На рисунке 1 показано схематическое представление посевом клеток и CLC: КТМ-1 инкубирования в протоколе 1. На рисунке 2 показано схематическое представление посевом клеток и Лей / PEP и CLC: КТМ-1 инкубации в протоколе 2. Рисунок 3 показывает схематическое представление посевом клеток и CLC: КТМ-1 инкубации и стимуляции в протоколе 3. на рисунке 4 показана sorLA-опосредованной CLC: КТМ-1-зависимой понижающая регуляция CNTFRα. На рисунке 5 показана sorLA-эндоцитоза и лизосомальных адресности CNTFRα. На рисунке 6 показан нижний ответ на CLC: КТМ-1 после стимуляции CNTFRα понижающей. Обратите внимание, что полосы, обозначающие CNTFRα-Myc имеют аналогичную плотность в нулевой момент времени, в то время как подавление CNTFRα-Myc демонстрируют более слабой полосы в sorLA трансфектантов AFTEг 5 ч (рисунок 4). На рисунке 5 показано , что CNTFRα-Мус накопилось в LAMP-1 положительных везикул Лей / бодрости духа обработанных клетках. В противоположность этому, никакого накопления CNTFRα-Мус не наблюдается в клетках, не подвергнутых обработке Leu / PEP. Это свидетельствует о том, что CNTFRα-Мус сортируется в лизосомы и деградируют. Как можно видеть на рисунке 6, уровень pSTAT3 значительно снижается в предварительно стимулированных клеток , по сравнению с уровнем в клетках , которые не были подвержены CLC: CLF-1. Это согласуется с наблюдаемым sorLA-опосредованной понижающей регуляции CNTFRα в предварительно стимулированных клеток (рисунок 4). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig1.jpg" /> Рисунок 1: Схематическое изображение посевом клеток и CLC: КТМ-1 инкубации в протоколе 1. семенной HEK293-CNTFRα-Myc и HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA клеток в двух 4-луночные планшеты (0 и 5 ч) и инкубировать клетки с CLC: КТМ-1, как указано. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig2.jpg" /> Рисунок 2: Схематическое изображение посевом клеток и Лей / бодрости духа и CLC: КТМ-1 инкубирование в протокол 2. семенной HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA клеток на покровных слайды в 4-луночного планшета и инкубировать клетки с или без лея / бодрости духа и CLC: КТМ-1, как указано. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig3.jpg" /> Рисунок 3: </sЧонг&gt; Схематическое представление посевом клеток и CLC: CLF инкубации и стимуляции в протокол 3. семенной HEK293-sorLA клеток в одном 4-луночного планшета и инкубировать клетки с или без CLC: (. пре-EXP) CLF-1 до подавляют CNTFRα с последующим CLC: КТМ-1 стимуляции (. стим), чтобы инициировать STAT3 фосфорилирования, как указано. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig4.jpg" /> Рисунок 4: Результаты , показывающие , что SorLA посредничает CLC: КТМ-1-зависимой понижающая регуляция CNTFRα. (А) НЕК293-CNTFRα-Мус и клетки (B) НЕК293-CNTFRα-Мус / sorLA инкубировали в отсутствие (белые столбцы) или в присутствии (серые столбцы) 10 нМ CLC: CLF-1. После того, как 0 и5 ч, инкубацию прекращали и содержание CNTFRα-Мус в среде (м), а также в клеточных лизатов (л) определяли с помощью Вестерн-блоттинга и количественно с помощью денситометрии. Верхние панели показывают Вестерн-блот результаты репрезентативных экспериментов и нижние панели показывают обнаруженные уровни CNTFRα-Мус, найденные в клеточных лизатов. Уровни приведены по отношению к уровню CNTFRα-Мус в одиночных и двойных трансфектантов при 0 ч. Каждый столбец представляет собой среднее значение ± SEM (n = 3). р-значения рассчитаны с использованием критерия Стьюдента. Воспроизводится после оригинального рисунка 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig5.jpg" /> Рисунок 5:Результаты , показывающие , что SorLA посредничает эндоцитоз и лизосомальных адресности CNTFRα. НЕК293-CNTFRα-Мус / sorLA клетки обрабатывали или без Лей / PEP, инкубировали с 10 нМ CLC: КТМ-1 в течение 5 ч, фиксированы, и, наконец, окрашивали с использованием анти-CNTFRα и анти-LAMP-1 антител, как описано в протоколе 2. Шкала баров: 5 мкм. Воспроизводится после оригинального рисунка 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig6.jpg" /> Рисунок 6: SorLA опосредованную понижающая регуляция CNTFRα сопровождается пониженным клеточным ответом на CLC: КТМ-1 стимуляции. НЕК293-sorLA клетки предварительно инкубировали в отсутствие или в присутствии 10 нМ CLC: (. Пре-ехр) КТМ-1 в течение 5 ч, голодали в БланK среда в течение 90 мин, и стимулировали 5 нМ CLC: (. стим) КТМ-1 в течение 15 мин. (Слева) Столбцы показывают относительные уровни pSTAT3 в клетках. Каждый столбец представляет среднее значение ± SEM (n = 3) по отношению к уровню pSTAT3 в клетках, предварительно инкубированных в отсутствие CLC: КТМ-1, но стимулированные CLC: КТМ-1. р-значение, вычисленное с использованием критерия Стьюдента. (Справа) Вестерн - блот показывает ответ pSTAT3 и STAT3 полученные в типичном эксперименте. Воспроизводится после оригинального рисунка 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃŽÂ± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry at JoV

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

Настоящий протокол описывает, как Вестерн-блоттинга и иммуноцитохимия в сочетании с ингибированием лизосомальных ферментов могут быть использованы для демонстрации понижающей регуляции цилиарного нейротрофического рецептор фактора-альфа (CNTFRα), который транспортируют посредством взаимодействия между цитокинами фактор-1 (CLF-1 ) и эндоцитотический рецептора sorLA.

SorLA и CLC: КТМ-1-зависимый Подавление CNTFRα в продемонстрированной Вестерн-блоттинга, ингибирование лизосомальных ферментов и иммуноцитохимию

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Западных Blotting протокол для небольшого числа гемопоэтических стволовых клеток

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Кортизол Измерение в Коала (Phascolarctos cinereus) Мех

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...