Name: microrna-based regulation of picornavirus tropism
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism at JoVE.com

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

1. क्लोनिंग microRNA रिस्पांस वायरल जीनोम में तत्वों <ol><li> डिजाइन microRNA प्रतिक्रिया तत्व सम्मिलित करता है। <ol><li> वांछित microRNA और अपनी इसी लक्ष्य अनुक्रम को पहचानें। कई डेटाबेस परिपक्व microRNA दृश्यों के साथ उपलब...

डिजाइन, रचना और वायरल जीनोम के भीतर microRNA प्रतिक्रिया तत्वों के स्थानीयकरण को निशाना प्रभावकारिता और विशिष्टता हुक्म चलाना होगा। इन अनुकूलन परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होगी। हालांकि, आरएनए संरचनात?...

प्रतिबंधित tropism के साथ एक वेक्टर इंजीनियरिंग के लिए एक मोटे तौर पर लागू आसान और प्रभावी पद्धति के विकास के सुरक्षा, जैविक समझ और वायरस के चिकित्सीय उपयोगिता को बढ़ाने के लिए एक प्रमुख अवसर प्रदान करता है। कई तंत्र transductional, ट्रांसक्रिप्शनल, और translational आधारित तकनीकों सहित वायरल tropism को लक्षित करने के लिए मौजूद हैं। हालांकि, इन तरीकों नहीं आम तौर पर सभी वेक्टर सिस्टम के लिए लागू है, लक्षित कोशिकाओं में दोषपूर्ण संकेत दे रास्ते की आवश्यकता होती है या वायरल जीनोम में बड़े कोडिंग दृश्यों की प्रविष्टि की आवश्यकता हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों वायरस के क्षीणन में परिणाम कर सकते हैं, काफी उनके चिकित्सीय गतिविधि निरोधक और असंशोधित प्रणाली में अंतर्दृष्टि सीमित। MicroRNAs छोटे (22-25 न्यूक्लियोटाइड) गैर-कोडिंग RNAs कि कोशिकाओं में जीन मुंह बंद करने के लिए मध्यस्थता कर रहे हैं। मैसेंजर आरएनए में पूरक लक्ष्य दृश्यों (प्रतिक्रिया तत्व) बाध्यकारी (mRNA) resulti द्वारा MicroRNAs समारोह<html> प्रतिलेख अस्थिरता, गिरावट या translational दमन में एनजी। MicroRNAs सामान्य रूप से आंशिक पूरकता के साथ प्रतिक्रिया तत्वों बाँध और जीन अभिव्यक्ति 1, 2, 3, 4, 5 में छोटे संशोधनों निकलेगा। जीन अभिव्यक्ति में अधिक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रतिक्रिया तत्व 6 की पूरकता बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। परिपक्व microRNAs हजारों सेल और ऊतक प्रकार 7, 8, 9 की एक किस्म में प्रजातियों और कई प्रदर्शनी अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न के एक किस्म में पहचान की गई है। ये microRNA हस्ताक्षर, वायरल जीनोम 10 में पूरी तरह से पूरक प्रतिक्रिया तत्वों को शामिल करके वायरस प्रवर्धन की सेल विशिष्ट प्रतिबंध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13। इस microRNA को लक्षित तकनीक के समग्र लक्ष्य के अतिरिक्त क्षीणन बिना एक वेक्टर जीनोम के tropism नियंत्रित करने के लिए है। वायरल tropism को विनियमित करने के लिए इस विधि की उपयोगिता मूल lentiviral वैक्टर में प्रदर्शन किया गया विशिष्ट ऊतकों 14, 15, 16 में transgene अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने के लिए। इस तकनीक को बाद में 17 नकल और बढ़ाया जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर गैर नकल के रूप में अच्छी तरह से सामान्य ऊतकों 10, 11, 12, 13 में अवांछित विषाक्तता को नष्ट करने से कई oncolytic वायरस की सुरक्षा प्रोफाइल में सुधार करने के लिए, का एक विशाल सरणी के लिए लागू किया गया है । यह भी सुरक्षित और ई उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया हैffective लिव-तनु टीके के रूप में भी सुधार करने के लिए वायरस और टीका विनिर्माण प्रक्रियाओं 18, 19, 20, 21। MicroRNA को लक्षित एक सदिश की जबकि निर्माता प्रणालियों में जंगली प्रकार के विकास के स्तर को बनाए रखने टीका मेजबान या लक्षित सिस्टम में क्षीणन के लिए अनुमति दे सकते हैं। MicroRNA-लक्ष्य-निर्धारण भी एक प्रजाति (जैसे मनुष्य) में संचरण सीमित है, जबकि अन्य मेजबान 22 में संचरण बनाए रखने के द्वारा अनुसंधान प्रयोजनों के लिए वायरस की जैव सुरक्षा में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, microRNA-लक्ष्य में गहराई से वायरल विकास 23, 24, 25, 26 को अलग से वायरल जीवन चक्र और रोगजनन और प्रतिरक्षा में प्रकार की कोशिकाओं के विशिष्ट भूमिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकते हैं। इस तकनीक में एक Alt प्रदान करता हैसभी वायरस सिस्टम के लिए लक्षित तरीका है कि आसानी से लागू किया जाता है और लागू ernative। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ परिपक्व microRNAs की कभी विस्तार संग्रह इस तकनीक अत्यधिक बहुमुखी बनाता है। MicroRNA आधारित लक्ष्य-निर्धारण प्रणाली समारोह समझौता किए बिना वायरस सिस्टम की एक किस्म के लिए प्रभावी साबित कर दी है। इस तकनीक के प्रमुख सीमाओं परीक्षण और त्रुटि के अनुकूलन, भागने म्यूटेशन के लिए क्षमता, और अंतर्जात टेप पर संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव शामिल हैं। हालांकि, इन सीमाओं को आम तौर पर अनुकूलित और तर्कसंगत प्रतिक्रिया तत्व डिजाइन के साथ दूर किया जा सकता है। सकारात्मक भावना आरएनए वायरस उनके जीनोम की सकारात्मक भावना अभिविन्यास और पूरी तरह से cytoplasmic प्रतिकृति चक्र के दौरान microRNA मशीनरी के लिए टेप की उपलब्धता की वजह से microRNA-लक्षित करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हो जाते हैं। यहाँ हम एक microRNA-लक्षित picornavirus और experim पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनअंदरूनी तरीकों दक्षता और है कि इन विट्रो में लक्षित की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">RE encoding Oligonucleotides</td>
			<td style="width:119px;">IDT</td>
			<td style="width:167px;">PAGE-Purified Ultramer</td>
			<td style="width:247px;">Sequence Designed by Investigator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Oligonucleotides encoding unique restriction site</td>
			<td style="width:119px;">IDT</td>
			<td style="width:167px;">25nM</td>
			<td style="width:247px;">Sequence Designed by Investigator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Expand High Fidelity PCR Kit</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">11732641001</td>
			<td style="width:247px;">Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">T4 DNA Ligase System</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:167px;">M0202S</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">MEGAscript Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">AM1333</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">MEGAclear Kit</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">AM1908</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">AM9260G</td>
			<td style="width:247px;">RNase-free</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">5 M NH4 Acetate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:247px;">Comes in MEGAclear Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">BP2818100</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">AM9938</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">TransIT-2020 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:119px;">Mirus</td>
			<td style="width:167px;">MIR 5404</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">TransIT-mRNA Transfection Reagent</td>
			<td style="width:119px;">Mirus</td>
			<td style="width:167px;">MIR 2225</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:167px;">SLGP033RS</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">2mL Screw-Cap Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:167px;">72.694.005</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Cell Scrapers</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">08-100-241</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">MicroRNA Mimics</td>
			<td style="width:119px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:167px;">Varied</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">MTT Cell Proliferation Assay</td>
			<td style="width:119px;">ATCC</td>
			<td style="width:167px;">30-1010K</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">18265017</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:247px;">pBlueScript II Vectors</td>
			<td style="width:119px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:167px;">Variable (e.g. 212205)</td>
			<td style="width:247px;">There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna-based regulation of picornavirus tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

तालिका 1 एक picornavirus के लिए एक अनुमापन परख की ठेठ परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है और बताता है कि 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक की गणना करने के लिए। इस पांडुलिपि में वर्णित वायरल tropism की microRNA आ?...

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MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Picornavirus 【tropism की MicroRNA आधारित विनियमन

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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प्रवाह कार्यात्मक और आण्विक अध्ययन के लिए प्राथमिक murine प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के cytometric अलगाव

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Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं पर Phagocytosis Assays के लिए सुअर या गोजातीय फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर शुद्धीकरण

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

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रासायनिक अवरोधक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के माध्यम से टी सेल रिसेप्टर संकेतन के मध्यस्थों की पहचान

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